应用16srrnardna基因检测小鼠糖尿病模型肠道菌群

应用16srrnardna基因检测小鼠糖尿病模型肠道菌群

体肠菌群是一个复杂的微生态系统。由于细菌培养手段的局限性，我们对其结构和组成知之甚少。近年来,随着分子生物学技术在感染微生态学上的应用,根据细菌16SrRNA序列的分类,发现肠道内寄住的微生物群的种类超过800种。近年来,有关肠道菌群与机体代谢平衡方面又提出了一个新观点:2型糖尿病和肥胖与高脂饮食所激发的机体轻度炎症反应密切相关,也发糖尿病病人血清中脂多糖升高,这很有可能是,肠道菌群和糖尿病相互作用的结果。本研究根据不同细菌的16SrDNA序列设计特异性引物,应用荧光实时定量PCR法对糖尿病小鼠肠道菌群中的双歧杆菌属、乳酸杆菌属、肠球菌属和大肠杆菌这几种代表菌属进行定量分析,比较糖尿病小鼠与正常对照之间的肠道菌群差异。一、材料和方法1.细菌基因组dna抽提三羟甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA)、无水乙醇(均为上海化学试剂厂);标准菌株(学校保存购于北京生物制品所);十二烷基硫酸钠(SDS)、蛋白酶K、溶菌酶、柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(均购自上海生物工程公司);DNA分子标准Marker及TaqDNA多聚酶(购自Qiagen公司)。2.stz注射有效模型清洁级昆明小鼠(18-22g),雄性,由杭州师范大学动物中心提供。小鼠空腹18h,腹腔注射STZ(80mg/kg),72h后以相同剂量加强注射1次。4周后,以血糖值>11mmol/L为造模成功标准,随机取15只小鼠作为模型组,另15只不做STZ注射,作为正常对照组。再饲养8周进行实验。3.测试方法(1)细菌基因组dna的制备以无菌方法取小鼠的新鲜粪便,置于无菌试管内,并迅速置于-80℃低温冰箱内保存。称取0.2g粪便标本中加200μL含溶菌酶的TE(溶菌酶浓度20mg/mL),用移液尖混匀。室温下孵育40min加入试剂盒中提供的消化缓冲液400μL,混匀;再加入3μL蛋白酶K,混匀后55℃保温2-3h。离心,上清液加入260μL无水乙醇,混匀后转至细菌基因组DNA抽提柱中。离心、重复3次,离心管中收集的液体即为细菌基因组DNA。(2)乳酸杆菌属及肠球形属5双歧杆菌属(350bp)F:5′ACCCTGGTAGTCCACGCCGTAA3′;R:5′GGCACAATCCGCTGGCAACA3′。乳酸杆菌属(165bp)F:5′ACGGGAGGCAGCAGTAGGGA3′;R:5′AGCCGTGACTTTCTGGTTGATT3′。肠球菌属(274bp)F:5′TCCACGCCGTAAACGATGAG3′;R:5′GACACGAGCTGACGACAACC3′。大肠杆菌(317bp)F:5′GGAGCAAACAGGATTAGATACCC3′;R:5′AACCCAACATTTCACAACACG3′。(3)确定od值及浓度以各标准菌株PCR产物经切胶、回收后所得的DNA片段作为荧光定量PCR的标准品,用紫外分光光度计测定OD值及浓度,换算为各标准品1μL的拷贝数(长双歧杆菌2.66×1011,嗜酸乳杆菌1.85×1011,大肠杆菌1.70×1011,粪肠球菌3.88×1011),用于制作标准曲线。(4)pcr反应体系将待测粪便样品中提取的DNA分别进行4种细菌16SrDNA荧光定量PCR反应,反应体系和反应条件与标准曲线制备时相同。每次实验同时设标准品校正和ddH2O代替DNA模板的阴性对照,每个样品均同时做3个平行复孔。反应完毕后根据融解曲线分析PCR产物的特异性。4.统计学处理方法样品定量数据导入Prism5.01统计软件进行分析。计量资料结果以x¯±sx¯±s表示,应用t检验比较组间差异。以P<0.05为差异有统计学意义。二、结果1.体重、糖尿病大鼠血糖情况体重从开始实验始到12周结束,糖尿病组小鼠体重明显比正常组轻(P<0.01),糖尿病组小鼠血糖明显比正常组高(P<0.01)。2.实时荧光定量pcr检测每份粪便标本所含的4种细菌的拷贝数可通过Ct值与标准菌株的标准曲线比较得到,由实时荧光定量PCR仪通过系统内置的软件处理后直接给出定量结果(附表)。三、srrna实时荧光定量pcr检测在人身体的体表及其与外界相通的腔道,如口腔、鼻腔系统、咽喉腔、眼结合膜、肠道及泌尿生殖道等部位都有大量的微生物的存在,其中一部分为长期寄居的微生物,在机体防御机能正常时是无害的,称为正常菌群或正常微生物群。正常菌群对人体有益无害,而且是必须的。正常菌群是由相当固定的细菌组成,有规律地定居于身体一些特定部位,成为身体的一个组成部分。这些益生菌是通过口服的活的细菌,数量丰常多,能在结肠定植。16srRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列,存在于所有细菌的染色体基因组中。16srRNA具有高度的保守性和特异性以及该基因序列足够长(包含约50个功能域)。随着PCR技术的出现及核酸研究技术的不断完善,16srRNA基因检测技术已成为病原菌检测和鉴定的一种强有力工具。数据库的不断完善,应用该技术可以实现对病原菌进行快速、微量、准确简便地分类鉴定和检测。该技术主要有三个步骤:首先是基因组DNA的获得,其次是16srRNA基因片段的获得,最后是进行16srRNA基因序列的分析。本实验室16SrRNA实时荧光定量PCR检测方法的建立,将为正确定量检测肠道中的细菌菌群数量提供一种特异性高、敏感性强的实验方法。CANI等通过研究发现,先给小鼠高脂饮食诱导其肠道菌群紊乱,然后补充益生元乳果糖,发现肠道双歧杆菌数量可以恢复。而双歧杆菌可以降低肠道内毒素水平,提高肠黏膜屏障功能,改善由高脂饮食所诱发的糖尿病。在喂食纤维性益生元的小鼠显示血浆内毒素水平正常,糖耐量提高,胰岛素释放正常。ARTIN等在给定植有婴儿肠道菌群的无菌小鼠喂食益生菌后,导致了一系列组织代谢的改变,从而影响机体的能量、脂肪和氨基酸代谢。这些实验数据表明了肠道菌群在维护机体代谢平衡中所起的作用。通过补充益生菌双歧杆菌,能有效减轻人体体重增加、肝脂肪性变及其他相关的代谢性紊乱。除了肠道菌群对机体能量和代谢的调节,肠道菌群通过改变食物成分可导致机体出现多种代谢变化,而这种变化有时有利于健康,有时也可以产生相反的效果。进一步的实验发现,高脂饮食能够有效改变肠道中的优势菌群,其中双歧杆菌、球菌和类杆菌减少,这有助于G-/G+菌比例的增加。因此血浆中LPS升高、肝脏糖原沉