补肾活血方对多囊卵巢大鼠pai-1基因表达的影响

补肾活血方对多囊卵巢大鼠pai-1基因表达的影响

多囊卵巢综合征（pc0s）是一种常见的妇科疾病，是由无排气性卵岐肌疾病引起的最常见原因。其表现为双侧卵巢多囊性改变,卵巢成熟障碍。文献表明,PCOS患者血清PAI-1水平有明显增高。本实验用实验性大鼠PCOS作研究模型,观察了PAI-1mRNA在PCOS卵泡发育过程中的表达,探讨了纤溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1mRNA)在PCOS病理生理中可能的作用机制,现将实验方法及结果报道如下。1材料和方法1.1材料表面1.1.1动物1.1.2药品、药品与药品补肾活血方(紫石英、锁阳、覆盆子、菟丝子、山萸肉、地龙、三七、泽泻、泽兰、甘草等)浓缩煎液,实验用药高剂量组含量生药分别为3.74g/mL、低剂量组1.87g/mL(由湖南中医药大学中西结合实验室统一制备,药品编号200010101);注射用绒促性素(安徽新力药业股份有限公司马鞍山厂生产,批号030409);左炔诺孕酮硅胶棒(上海达华制药厂生产,批号002212,每根含75mg左炔诺孕酮);克罗米酚(上海衡山药业有限公司生产,批号020502)。1.1.3npt/lkm1142PAI-1原位杂交检测试剂盒ISHDetectionKit(MK1142),武汉博士德生物工程有限公司产品;左旋聚赖氨酸(poly-L-lysine)、DEPC(pyrocarbonate)、PBS溶液等。1.2方法1.2.1左炔诺孕酮的注射选用24d龄未成年雌性SD大鼠60只,随机分为模型组和正常对照两组。其中模型组48只,皮下埋植左炔诺孕酮硅胶棒(3mm),在27d时每天2次皮下注射1.5IU绒促性素,共注射9d,即至第36天。正常对照组每天注射同容积生理盐水,连续给药9d。1.2.2补二通道体性肾等为酰氯类,多次给药将造模后大鼠又随机分为模型组、正常组、补肾活血方高剂量组、补肾活血方低剂量组(以下分别简称补肾方高、低剂量组)和克罗米酚组,每组12只。补肾方高、低剂量组于第37天开始,每天分别灌胃高剂量补肾活血方37.4g/(kg·d),相当于成人等效剂量2倍,低剂量18.7g/(kg·d),相当于成人等效剂量1倍,连续给药30d,药物剂量按照60kg成人体表面积换算;克罗米酚组于第51天时开始给药,每天灌胃克罗米酚0.0045g/kg,连续给药5d;模型对照组,每天灌胃生理盐水10mL/kg;正常对照组正常喂养。1.3指标检测1.3.2pai-m1r-na原位杂交取出卵巢,剥离干净后放入4%多聚甲醛中固定,各级乙醇脱水,石蜡包埋,切片,切片厚约10~20μm,进行PAI-1mR-NA原位杂交,显微镜检并电脑摄像,图像分析卵巢PAI-1mRNA信号表达强度。1.4统计学处理所有数据,均采用SPSS13.0统计软件包进行处理,计量资料均采用表示,符合正态性和方差齐性的数据用单因素方差分析,样本间两两比较用q检验,不符合上述条件用秩和检验。2结果2.1各组大鼠卵巢色泽的比较卵巢的大体观察:模型组卵巢苍白,增大,表面见卵泡,但卵泡数目少,卵泡较小,无黄体;正常组和中药组以及阳性组大鼠卵巢色泽鲜红,卵泡数目明显多于模型组,卵泡明显增大,表面见较多黄体。提示补肾活血方能增加各级卵泡总数。2.2所2对pai-m1na表达的影响结果表明,模型组与正常组比较,卵巢局部PAI-1mRNA的表达超过正常组,差异具有统计学意义(P<0.01)。经补肾方高、低剂量组及克罗米酚组用药后,卵巢组织PAI-1mRNA的表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01),说明补肾方高、低剂量组和克罗米酚组对PAI-1mRNA的表达都具有抑制作用。补肾方高、低剂量组与克罗米酚对照组比较,高剂量组抑制作用优于克罗米酚组,差异具有统计学意义(P<0.01);补肾活方高、低剂量组比较,高剂量组抑制作用与低剂量组相比无明显优势,差异无统计学意义(P>0.05)。光镜下观察,各组PAI-1mRNA在卵泡膜细胞、间质细胞、颗粒细胞中表达呈现棕色反应,但各组的PAI-1mRNA的表达强度不一。说明PCO大鼠卵巢组织PAI-1mRNA表达明显升高,而补肾方可明显降低PAI-1mRNA的高表达。结果见表1、图1。结果提示:补肾活血方能很好地抑制PAI-1mRNA的高表达,降低PAI-1mRNA在卵巢局部的作用,从而促进卵泡的发育和卵巢的排卵。3滤泡壁的正交实验多囊卵巢综合征(polycysticovarysyndrome,PCOS)是妇科常见的生殖功能障碍性疾病,主要表现为卵巢的雄激素过多及无排卵。其基本病理生理特点是卵巢多囊性改变、高雄激素血症、高促黄体生成素(LH)、胰岛素抵抗等。PCOS异常的内分泌环境阻碍了正常卵泡发育,对卵巢间质也有影响,高LH、高雄激素水平可刺激卵巢白膜胶原纤维增生,形成胶原纤维束宽带,使白膜异常增厚,导致卵泡不易破裂。哺乳动物卵巢滤泡由纤蛋白和胶原样结缔组织包被。排卵时卵子要从滤泡中逃脱,除包围在卵细胞外周的底部的卵丘细胞必须与颗粒层细胞分离外,滤泡壁的同步有限破裂是关键条件。有充分实验证明,纤溶酶原激活因子所产生的蛋白水解作用与卵丘细胞的膨胀和扩散以及与滤泡壁破裂密切相关。PA在细胞间或细胞表面上的局部蛋白水解作用严格受到它们的特异抑制因子的调控和制约,以便保证在非常特异和定向完成局部的细胞外基质(ECM)局部降解时不危害临近的细胞和组织,而且能迅速恢复其功能。且实验已证明,tPA和PAI-1在卵巢不同细胞中的协同表达可诱发排卵。本实验结果提示大鼠PCO模型卵巢局部PAI-1mR-NA存在异常高表达,补肾活血方具有改善这种异常表达作用,可能是其促进卵巢排卵的机制之一。中医学虽无该病的专门记载,但据其症状,可归属与中医学“月经后期”、“闭经”、“崩漏”、“癥瘕”、“不孕”等范畴。肾气亏虚卵子难以发育成熟是排卵功能障碍的根本原因,历代医家认为这些疾病多由禀赋薄弱,肾气不盛,天癸不至,冲任失养,或房劳多产伤肾,精血亏少,冲任虚损;肾阳虚不能温化肾阴化生肾气,肾气不足则影响天癸的泌至和冲任的通盛,遂致冲任运行不畅而瘀滞于内,瘀血内阻,阻碍卵子顺利排出。本方对治疗肾虚血瘀型多囊卵巢综合征的临床功效已被证实。此外研究发现,益肾活血中药具有抑制PAI活性,清除因血瘀沉积在血管床上的纤维蛋白,以阻止血栓形成,其作用益肾活血药又优于单纯活血化瘀药。总之,本研究从分子生物学角度进一步阐明中药治疗PCOS的机制,为中药治疗PCOS提供了有力的依据。选取未成年24d龄SD雌性大鼠,体质量(50±5)g。由专人饲养,喂以大鼠颗