GB 4789.36-2016 大肠埃希氏菌O157：H7NM检验 好

食品安全国家标准

食品微生物学检验

大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验NationalfoodsafetystandardFoodmicrobiologicalexaminationExaminationofEscherichiacoliO157:H7/NMGB4789.36-2016浙江工商大学赵广英2016-12-23发布2017-06-23实施食品安全国家标准

食品微生物学检验

大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验NationalfoodsafetystandardFoodmicrobiologicalexaminationExaminationofEscherichiacoliO157:H7/NMGB4789.36-2016浙江工商大学赵广英2016-12-23发布2017-06-23实施NM：没有鞭毛，无动力菌株重点：检验程序及其各部分的原理难点：全面掌握检验程序并理解其各部分的原理课时数：1课时CompanyLogo致泻大肠埃希氏菌有5类：

肠道致病性大肠埃希氏菌(

EnteropathogenicEscherichiacoli，EPEC）肠道侵袭性大肠埃希氏菌（EnteroinvasiveEscherichiacoli,EIEC）

产肠毒素大肠埃希氏菌（EnterotoxigenicEscherichiacoli,ETEC）

产志贺毒素大肠埃希氏菌(

Shigatoxin-producingEscherichiacoli,STEC)

***(肠道出血性大肠埃希氏菌EnterohemorrhagicEscherichiacoli,EHEC)

肠道集聚性大肠埃希氏菌(EnteroaggregativeEscherichiacoli,EAEC)

O157:H7/NM是EHEC的代表，近几年危害严重，受到重视！O（菌体）抗原；H（鞭毛）抗原；K（荚膜）抗原；F（菌毛）抗原CompanyLogo序1.流行病学简述2.生物学特性3.培养基和试剂4.检验程序及方法

image/e_colio157(1).jpg第一部分致病菌概述E.coliO157:H7概况病特征：引起出血性肠炎的血性腹泻、肠痉挛，溶血性尿毒综合症(HUS)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)等严重的并发症。后者病情凶险，病死率极高。疫情：肠出血性大肠埃希氏菌(EHEC)

O157:H7感染性腹泻是近年来新发现的危害严重的肠道传染病。包括我国在内的世界许多国家都有疫情发生（食物中毒）序CompanyLogo

首发：

1982年美国牛肉中毒；依据1999年的评估,美国每年发生73000例感染,并造成61人死亡。虽然此疾病大多与食用未完全煎熟的受污染汉堡包肉饼有关,也多见于食用受污染的生豆芽或新鲜多叶蔬菜而感染,例如莴苣叶、菠菜、生菜等。

扩散和蔓延：相继在英国、加拿大、日本等许多个国家引起腹泻暴发和流行。历史CompanyLogo

*1993年，JackInTheBox(美国家喻户晓的知名快餐连锁店之一,引导汉堡潮流)快餐连锁店出售未煮熟的污染汉堡引起700多人（以儿童为主）食物中毒，并造成4人死亡。这一事件使大肠杆菌O157:H7臭名远扬。5*2001年夏天，在大肠杆菌O157:H7爆发殃及35人之后，北美乃至全球最大的食品公司之一

ConAgraFoods立刻召回了怀疑受到污染的1900万磅碎牛肉。

事件CompanyLogo*1998年，佐治亚州亚特兰大水上公园发生的大肠杆菌O157:H7大爆发使得多名儿童住院。

*1996年5-8月，日本中学和幼儿园相继发生多起大肠杆菌O157集体中毒事件，波及44个地区，7万例，死亡12人.与芽菜有关。CompanyLogo2014年08月10日日本静冈市政府９日宣布，在该市发生大规模食物中毒事件后，从患者体内检测出了肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７，截至９日，发病者达到４４９人。这是１０年来由出血性大肠杆菌Ｏ１５７导致的最大规模的集体食物中毒事件。7月26日静冈市烟花大会的游客吃了摊贩卖的冰腌小黄瓜的集体食物中毒案，总计有453人被检验出含出血性大肠杆菌O157，其中108人病情较严重住院。有4人出现溶血性尿毒症候群(HUS)。CompanyLogo1997年在一定范围内开展监测，已陆续有十余个省份在市售食品、进口食品、腹泻病患者、家畜家禽等分离到该菌，并在1999年我国苏皖毗邻地区突然暴发了肠出血性大肠杆菌O157:H7，患者表现腹泻、急性肾功能衰竭，因多器官受损死亡。2000年，卫生部发布了

《全国肠出血性大肠杆菌O157:H7感染性腹泻监测方案（试行）》，为进一步加强我国重点地区的监测工作，特制订此方案。我国疫情CompanyLogo1.流行病学简述O157:H7属于肠出血性大肠杆菌。发病季节性强，多发生于夏秋两季，7-8月为发病高峰。它主要通过污染的食物像人类传播。一般认为100～200个大肠杆菌O157:H7细胞就能使人中毒，而其他致泻性大肠杆菌通过食物感染人需要100万个以上的细胞。其致病机理包括黏附和产毒两方面。肠痉挛和血性腹泻是O157:H7感染后的典型症状。易感人群多为5岁以下小孩及老人。CompanyLogo2.生物学特性G-，无芽胞，有鞭毛和菌毛，需氧兼性厌氧中小杆菌。

genomics/images/e_coli_200.jpg1)形态与染色CompanyLogo2)生长特性耐低温能在冰箱内长期生存在自然界的水中可存活数周至数月对氯敏感被1mg/L的余氯浓度杀灭不耐热75℃1min即被灭活EHECO157:H7具有较强的耐酸性pH2.5-3.0，37℃可耐受5小时最适生长温度为33-42℃，37℃繁殖迅速，44-45℃生长不良，45.5℃不生长CompanyLogo3）EHECO157:H7/NM

生化反应特性MR-VP试验纤维二糖发酵氧化酶试验+MR(+)VP(-)--山梨醇发酵

赖氨酸脱羧酶

鸟氨酸脱羧酶棉子糖发酵阴性或迟缓发酵，其它EC＋阳性（紫色）

阳性（紫色）+三糖铁琼脂

MUG试验4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷动力试验西蒙氏柠檬酸盐底及斜面黄色，H2S(-)

阴性有动力或无动力-靛基质（吲哚）试验

注：红色字的是其区别于其它大肠埃希氏菌的特性O157:H7区别其它大肠埃希氏菌的特点①不发酵或迟缓发酵山梨醇；②4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷阴性；③44-45.5℃不易生长；④产大量Vero毒素（VT/类志贺氏毒素，SLT）虽然有uidA基因，但其编码的β-葡萄糖醛酸酶无活性，不能分解4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）产生荧光，即MUG阴性。产生大量的Vero毒素（VT），也称作类志贺氏毒素（SLT），是EHEC的主要致病因子。Vero毒素按免疫原性等方面的不同可分为VT1和VT2。EHEC除其代表菌株O157:H7外，还包括O157:NM、O26:H11、O111:H8、O125:NM、O121:H19、O45:H2、O4:NM、O145:NM、O5:NM、O91:H21、O103:H2、O113:H2等血清型的部分菌株。食品安全国家标准

食品微生物学检验

大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验NationalfoodsafetystandardFoodmicrobiologicalexaminationExaminationofEscherichiacoliO157:H7/NMGB4789.36-2016浙江工商大学赵广英2016-12-23发布2017-06-23实施前言本标准代替GB/T4789.36—2008《食品卫生微生物学检验大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验》。本标准与GB/T4789.36—2008相比,主要变化如下:—标准名称修改为“食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验”;—修改了标准的范围;—修改了设备和材料;—修改了培养基和生化反应的文字描述;—删除“第二法免疫磁珠捕获法的原理”;—删除“第三法全自动酶联荧光免疫分析仪筛选法”;—删除“第四法全自动病原菌检测系统筛选法”。1范围本标准规定了食品中大肠埃希氏菌O157:H7/NM(EscherichiacoliO157:H7/NM)的检验方法。本标准适用于食品中大肠埃希氏菌O157:H7/NM的检验。CompanyLogo2设备和材料2.1~2.10略2.11长波紫外光灯:365nm,功率≤6W。

2.12微量离心管:1.5mL或2.0mL。2.13磁板、磁板架、样品混合器。2.14微生物鉴定系统

3培养基和试剂3.1改良EC肉汤(mEC+n):见A.1。3.2改良山梨醇麦康凯琼脂(CT-SMAC):见A.2。

3.3三糖铁琼脂(TSI):见A.3。3.6月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-MUG(MUG-LST):见A.6。3.10亚碲酸钾(AR级)。3.11头孢克肟(Cefixime)。3.12大肠埃希氏菌O157显色培养基。3.13大肠埃希氏菌O157和H7诊断血清或O157乳胶凝集试剂。3.14鉴定试剂盒。3.15抗E.coliO157免疫磁珠大肠埃希氏菌O157显色培养基。CompanyLogo3.1改良EC肉汤（mEC+n)

:见A.1。

——用于O157选择性增菌

主要成分解析：

3

号胆盐抑杂菌

乳糖

产酸产气

新生霉素钠盐溶液抑杂菌3.2改良山梨醇麦康凯（CT-SMAC)琼脂：见A.2。

——依据最新标准制作，主要用于食品和食物中毒样品中大肠埃希氏菌O157

:

H7

和O157

:

NM

的检验

，分离培养用，36

℃

士1

℃

培养18h

一24h

。

主要成分解析：山梨醇

阴性或迟发酵

3

号胆盐

抑杂菌

中性红

显色剂6.8～8.0红~黄~橙

结晶紫

抑杂菌典型菌落为不发酵山梨醇（其他大肠杆菌为阳性）的圆形、光滑、较小，中心呈现较暗的原色小S菌落；发酵山梨醇的菌落为红色；E.coli

O157:H7和O157:H7/NM为阴性/迟缓

3.10-A.2.2亚碲酸钾（AR

级）

3.11-A.2.3头孢克肟（Ceflxitne)

CompanyLogo加到3.2中，抑制杂菌。有效储藏期：-20℃一年；

2℃--8℃，14d。

3.3三糖铁琼脂（TSI）见A.3。成分：葡萄糖：乳糖：蔗糖＝1：10：10；酚红:pH6.8--8.4(黄-红)；分解含硫氨基酸产生硫化氢和铁盐（硫酸亚铁铵）形成黑色；制备成柱状斜面功能：判断分解三种糖的能力；是否产生硫化氢。

E.ColiO157H7在TSI

琼脂中，分解葡萄糖和乳糖，典型菌株为斜面与底层均呈阳性反应呈黄色，产气或不产气，不产生硫化氢（H2S

）；3.4营养琼脂A.4和3.5半固体琼脂A.5略3.6

月桂基磺酸盐胰蛋白胨肉汤-MUG

(LST－MUG):A.6(-)

LST－MUG含4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG

)

本菌不含活性β-D-葡萄糖醛酸苷酶即(-)

月桂基硫酸盐（阴离子表面活性剂，主要作用是抑制G+菌）

乳糖＋

在CT-SMAC

和改良CHROMagar

O157

显色琼脂平板上挑取5

-10

个典型或可疑菌落，分别接种TSI

琼脂(三糖铁琼脂)，并接种MUG-LST肉汤，36

℃

士1

℃

培养18h-24h

.置MUG-LST

肉汤管于长波紫外灯下观察，无荧光产生者为O157菌阳性结果（其他E.Coli有葡萄糖醛酸苷酶－有荧光产生），有荧光产生者为O157菌阴性结果；对分解乳糖且无荧光的菌株，在营养琼脂平板上分纯，于36

℃

士1

℃

培养18h

一24h

，并进行后续鉴定，如必要时进行：3.7氧化酶试剂：A.7(-)3.8

革兰氏染色液：A.8

(-)

3.9PBS–Tween20洗液A.9；3.10和3.11在前面。3.12大肠埃希氏菌O157显色培养基。3.13大肠埃希氏菌O157和H7诊断血清或O157乳胶凝集试剂。3.14鉴定试剂盒。3.15抗E.coliO157免疫磁珠第一法常规检验法4.检验程序检样25g(mL)+225mL

mEC+n肉汤，均质

36℃±1℃18h～24hCT-SMAC平板和大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板36℃±1℃18h～24h挑取可疑菌落5个～10个，氧化酶-，G-

中小杆菌接种TSI，氧化酶—，G—MUG-LST36℃±1℃18h～24h实验阳性实验阴性非O157血清学试验生化试验报告初步生化实验三糖铁黄色可产气其它大肠杆菌有葡萄糖醛酸苷酶＋；O157—选择性增菌改良山梨醇不/迟缓发酵，中心呈现较暗的原色小S菌落分离鉴别显色培养无荧光－－纯培养改良山梨醇麦康凯微量多项生化试剂盒玻片凝集实验CompanyLogo5操作步骤说明增菌改良EC

肉汤（mEC+n

)分离划线或取0.1

mL

涂布接种于CT-SMAC

平板和改CHROMagar

O157

弧菌显色琼脂平板上注意：在CT-SMAC

平板上，典型O157菌落为不发酵山梨醇的圆形、光滑、较小的无色菌落，中心呈现较暗的灰褐色；其它菌发酵山梨醇的菌落为红色

stories/E.%20coli%20O157.jpg在改良CHROMagar

O157

杆菌显色琼脂平板上为圆形、较小的菌落，中心呈淡紫色—紫红色，边缘无色或浅灰色

CompanyLogo3.初步生化试验

在上述平板上挑取5

个一10

个典型或可疑菌落，分别接种TSI

琼脂，同时接种MUG-LST

肉汤，培养。

必要时进行氧化酶试验和革兰氏染色。在TSI

琼脂中，典型菌株为斜面与底层均呈阳性反应呈黄色，产气或不产气，不产生硫化氢（H2S

）。置MUG-LST

肉汤管于长波紫外灯下观察，无荧光产生者为O157阳性结果，有荧光产生者为阴性结果；对分解乳糖且无荧光的菌株，在营养琼脂平板上分纯培养，并进行下列鉴定。操作步骤说明CompanyLogo操作步骤说明4.1

血清学试验在营养琼脂平板上挑取分纯的菌落，用O157

:

H7

标准血清或O157

乳胶凝集试剂作玻片凝集试验。对于H7

因子血清不凝集者，应穿刺接种半固体琼脂，检查动力，经连续传代3

次，动力试验阴性，H7

因子血清凝集阴性者，确定为无动力株。

4.鉴定CompanyLogo操作步骤说明4.2

生化试验

用AP120E

生化鉴定试剂盒或VITEK-GNI+检测卡，按照生产商提供的使用说明进行.EHECO157:H7/NM生化反应特性第二法

免疫磁珠捕获法

CompanyLogoCompanyLogo7检验程序检样25g/mL+225mLmEC肉汤，均质O157免疫磁珠捕获富集CT-SMAC平板和大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板挑取可疑菌落5个~10个接种TSI，氧化酶阴性，G—MUG-LST阳性血清学实验生化试验报告非E.coliO157阴性36℃±1℃18h～24h36℃±1℃18h～24h36℃±1℃18h～24h鉴别培养改良山梨醇麦康凯无荧光玻片凝集实验；H因子血清不凝者，穿刺半固体检查动力，传代3次仍不凝者为无动力株（NM）原理（新国标略）

免疫磁珠捕获技术是通过对目的细菌进行选择性增菌，然后利用免疫磁珠进行选择性捕获的方法。捕获的目的细菌被结合到由抗体包被的磁性颗粒上，收集后再将磁性颗粒涂布到选择性琼脂平板上进行分离。在CT

-SMAC

平板上生长的可疑的大肠埃希氏菌O157,因为不分解山梨醇，或在E.coli

O157显色琼脂平板上产生特定的酶促反应呈现颜色变化，而与其他细菌相区别。免疫磁珠的应用，特别是在样品含有大量杂菌时，对检样中含有少量的大肠埃希氏菌O157：H7/NM的检出提供了更大的可能性。

检验程序基本同培养法，只是在选择性增菌后利用了免疫磁珠进行选择性捕获富集

复习思考题一、判断题1、E.coliO157:H7/NM是肠出血性大肠埃希氏菌(enterohemorrhagicE.coli，EHEC)的代表（）E.coliO157:H7/NM是肠出血性大肠埃希氏菌(enterohemorrhagicE.coli，EHEC)的唯一血清型（）E.coliO157:H7/NM肠道侵袭性大肠埃希氏菌(enteroinvasiveE.coli，EIEC)的代表（）E.coliO157:H7/引起特征性的病症是腹泻、肠痉挛、出血性肠炎腹泻，溶血性尿毒综合症(HUS)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)等严重的并发征。后者病情凶险，病死率极高。二、E.coliO157:H7区别于其他E.coli的生化特性：E.coliO157:H7区别于其他E.coli的生化特性是①不发酵或迟缓发酵山梨醇；②无有活性的β-葡萄糖醛酸酶，不能分解4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）产生荧光，即MUG阴性；③44-45.5℃不易生长；④产生大量的Vero毒素（VT），也称作类志贺氏毒素（SLT），是EHEC的主要致病因子。三、免疫磁珠的作用？CompanyLogoCompanyLogo天鹅花

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第三法

全自动酶联荧光免疫分析仪筛选法1原理mini

VIDAS

或VIDAs

EscherichiacoliO157分析，是在自动VIDAS

仪器上进行的双抗体夹心酶联荧光免疫分析（ELFA

）方法。固相容器（SPR

）用抗大肠埃希氏菌O157

抗体包被，各种试剂均封闭在试剂条内。mini

VIDAS

或VIDAS

和E.coli

O157

试剂条（VIDAS

ECO

）SPR试剂条原理煮沸过的增菌肉汤加入试条孔后，在特定时间内样本中的O157

抗原与包被在SPR

内部的O157

抗体结