GB 4789.40-2016 克罗诺阪崎肠杆菌检验 好

食品微生物学检验

克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验

Foodmicrobiologicalexamination：Cronobactersakazakii

(Enterobactersakazakii)

GB4789.40—20162016年12月23号发布2017年6月23号实施

第一部分概论

1、何为克罗诺阪崎肠杆菌？

克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobactersakazakii，C.sakazakii，曾名阪崎肠杆菌，黄色阴沟肠杆菌）为肠杆菌科克罗诺阪崎肠杆菌属的G－有周身菌毛无芽孢的中小杆菌，是人和动物肠道的“条件致病菌”,但却是婴幼儿（配方奶粉）的重要致病菌。菌落能产生黄色色素。

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2、C.sakazakii的危害？C.sakazakii能引起严重的新生儿脑膜炎、败血症和坏死性小肠结肠炎,并可能遗留严重的神经系统后遗症,死亡率达50%以上。2004年世界粮农组织和世界卫生组织经过风险性评估将C.sakazakii和肠炎沙门氏菌共同列为婴幼儿配方奶粉A类致病菌。A类致病菌：流行病学和微生物学有证据明确表明，污染的奶粉是婴儿患病的传播媒介或传染源的病原体；

B类致病菌：没有证据明确表明，污染的奶粉是婴儿患病的传播媒介或传染源的病原体的病原体，包括团聚肠杆菌、克雷伯肠杆菌和阴沟肠杆菌等。）3、阪崎肠杆菌的感染途径？越来越多的报道证明奶粉，特别是婴幼儿配方奶粉是被感染的媒介。国内外有不少品牌的婴儿奶粉曾检出过C.sakazakii。有调查表明，约2.5%—15%的婴儿配方奶粉中含有阪崎肠杆菌。

味全食品的三类配方奶粉2008年10月被检验出含有致病菌阪崎肠杆菌

-02/03/xin_100000000002196831991.jpg原装进口澳大利亚“澳优”奶粉检出阪崎肠杆菌

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新西兰“恒天然”是全球最大的乳品原料供应商生物学特性表明，阪崎肠杆菌可在整个奶粉生产过程和食用中存活。生长温度为6～45℃。因此，冲好的奶粉如果不及时食用，则C.sakazakii的数量可能迅速升高。4、为什么冲好的奶粉要一次喝完？

C.sakazakii显色培养基（DFI)琼脂上形成蓝绿色菌落

能利用柠檬酸盐作为唯一碳源5、C.sakazakii主要生化特性胰蛋白胨大豆琼脂（TSA)上形成黄色菌落，25℃时最明显L-赖氨酸脱羧酶（-）；L-鸟氨酸脱羧酶（+）L-精氨酸双水解酶(+)；氧化酶（-）磷酰胺酶活性：—*；不能发酵山梨醇；能发酵乳糖产酸产气发酵：α-葡糖苷酶：+**、

L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖、苦杏仁甙*和**：有学者研究认为，凭这两种酶的活性检测可将阪崎肠杆菌与其他肠杆菌明显地区分开来。MUYTJENS等在对226株(其中129株为阪崎肠杆菌，其他为阴沟肠杆菌60株，产气肠杆菌19株，聚团肠杆菌18株)肠杆菌的研究中，发现阪崎肠杆菌和其他肠杆菌之间存在两个主要的不同：阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶活性:阳性，磷酰胺酶活性:阴性。由此认为，凭两种酶活性检测可将阪崎肠杆菌与其他肠杆菌明显地区分开来，并且将α-葡萄糖酶苷活性检测可用来快速分离阪崎肠杆菌。(1)耐高温、干燥、渗透压

C.sakazakii比其他肠杆菌耐高温。Lehner研究发现C.sakazakii在婴儿配方奶粉中60℃存活2.5min，并且72℃仍能存活。由于C.sakazakii细胞内含有大量的海藻糖酶，累积有大量的海藻糖，使得C.sakazakii比沙门菌和其他肠杆菌更耐受渗透压和干燥。因C.sakazakii这些特性，使得奶粉生产时不易被杀灭，储存时易生存下来。6、抵抗力(2)耐酸性，并对清洁剂和杀菌剂有较强抵抗力

Lehner的实验表明，C.sakazakii能在pH0.9～2下存活(胃部的酸性环境)，可能与C.sakazakii周身菌毛结构有关，该菌毛结构易使细菌形成共生集合体，也易粘附在各种物体表面形成一层生物保护膜，对清洁剂和杀菌剂具有较强的抵抗力。6、抵抗力（续）

第二篇国标GB4789.40—2016食品微生物学检验

克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验

Foodmicrobiologicalexamination：Cronobactersakazakii

2016年12月23号发布2017年6月23号实施

前言本标准代替GB4789.40—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验》、SN/T1632.1—2013《出口奶粉中阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)检验方法第1部分:分离与计数》。本标准与GB4789.40—2010相比,主要变化如下:——标准名称修改为“食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验”;——修改了可疑菌落的挑取数量。1范围本标准规定了食品中克罗诺杆菌属（Cronobacter）的检验方法。本标准适用于婴幼儿配方食品、乳和乳制品及其原料中克罗诺杆菌属（细菌）的检验。

2设备和材料

略全自动微生物生化鉴定系统；3.1缓冲蛋白胨水（BPW)，见附录A中A.1。3.培养基和试剂前增菌培养3.2改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素见附录A中A.2。选择性增菌培养原理：胰蛋白胨:碳源和氮源乳糖:Cronobacter可发酵乳糖产酸产气月桂基硫酸钠(十二烷基硫酸钠)和万古霉素可抑制G+细菌的生长注意：mLST-Vm必须在24h之内使用（modifiedlaurylsulfatetryptosebroth-vancomycinmedium,mLST-Vm）

+3.3(C.sa)阪崎肠杆菌显色培养基琼脂（不同牌子原理不同，如DFI。略)鉴别显色培养，阪崎肠杆菌显蓝色，其他肠杆菌显无色

阪崎肠杆菌显色培养基

柠檬酸铁铵：铁为硫化氢试验阴性；柠檬酸为碳源铵为氮源（还有蛋白胨）脱氧胆酸钠：抑制杂菌；5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃葡萄糖苷：本菌含α-葡糖苷酶，分解α-葡糖苷，释放5-溴-4-氯-3-吲哚显色集团，在白/淡黄色平板上产生绿－蓝绿色菌落。3.4胰蛋白胨大豆琼脂（TSA)见附录A中A.3。用于奶粉中Cronobacter的纯化培养和产黄色素实验

3.5-3.10生化试剂和多种酶类培养基见附录A中A.4－A.83.5生化鉴定试剂盒。3.6氧化酶试剂：见附录A中A.4。—

3.7L-赖氨酸脱羧酶培养基：见附录A中A.5。—3.8L-鸟氨酸脱羧酶培养基：见附录A中A.6。＋3.9L-精氨酸双水解酶培养基：见附录A中A.7。＋3.10糖类发酵培养基：见附录A中A.8。主要成分和原理柠檬酸钠：唯一碳源，并产生碳酸钠，使培养基因产碱变为蓝色为阳性者结果。

酸性:碳酸<柠檬酸（碱性：碳酸钠>柠檬酸钠）磷酸二氢铵：提供氮源硫酸镁：生长辅助因子

溴麝香草酚蓝:生物指示剂,变色范围pH6.0(黄)-7.6(蓝)调培养基pH值为6.8

士0

.2(绿色).

3.11西蒙氏柠檬酸盐培养基：见A.9

用于肠道菌的柠檬酸盐利用试验＋蓝色

第一法克罗诺杆菌属定性检验缓冲蛋白胨水，前增菌选择性增菌44℃

选择性鉴别培养纯培养和产黄色素48h阪崎肠杆菌显色培养基挑取至少5个可疑菌落胰蛋白胨大豆琼脂改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素符合表1阪崎肠杆菌的主要生化特征，p3图1克罗诺杆菌属检验程序操作步骤说明1前增菌和选择性增菌

取检样100g（或100mL）加入已预热至44℃装有900mL缓冲蛋白胨水的锥形瓶中，用手缓缓地摇动至充分溶解，36℃±1℃培养18h±2h。移取1mL转种于10mLmLST-Vm肉汤，44℃±0.5℃培养24h±2h。36℃－44℃

2分离

(1)轻轻棍匀mLST-Vm肉汤培养物，各取增菌培养物1环，分别划线接种于两个DFI

平板，36℃±l℃培养24h±2h。

(2)挑取1个-5个可疑菌落（直径约1mm-3mm的蓝绿色菌落），划线接种于TSA平板。25℃±1℃培养48h±4h。操作步骤说明(续)3鉴定

自TSA平板上直接挑取黄色可疑菌落，进行生化鉴定。阪崎肠杆菌的主要生化特征见表1。表1阪崎肠杆菌的主要生化特征生化试验特征黄色素产生+氧化酶-L-赖氨酸脱羧酶-L-鸟氨酸脱羧酶（+）L-精氨酸双水解酶+柠檬酸水解（+）发酵D-山梨醇（-）L-鼠李糖+D-蔗糖+D-蜜二糖+苦杏仁甙+注：“+”>99%阳性；“-”>99%阴性；

“（+）”90%～99%阳性；“（-）”90%～99%阴性；3鉴定

自TSA平板上直接挑取黄色可疑菌落，进行生化鉴定。阪崎肠杆菌的主要生化特征见表1。6结果与报告

综合菌落形态和生化特征,报告每100g(mL)样品中检出或未检出克罗诺杆菌属。

根据证实为阪崎肠杆菌的阳性管数，查（见附录Ｂ中表B.1）MPN检索表，报告每100g（或100mL）样品中阪崎肠杆菌的MPN

值7.2分离、鉴定

8计数、报告7.1样品的稀释

36±1℃，24±2hDFI琼脂显色培养基挑取至少5个蓝绿色菌落固体、半固体或液体样品：无菌称取样品100g/mL、10g/mL、1g/mL各三份，分别加入900mL、90mL、9mL已预热至44℃的BPW中，制成1:10样品匀液，置36℃±1℃（增菌）培养18h±2h。分别移取1mL转种于10mLmLST-Vm肉汤，44℃±0.5℃（择性增菌）培养24h±2h选。TSA25±1℃，48±4h挑取黄色菌落生化鉴定第二法阪崎肠杆菌的计数7操作步骤选择性鉴别培养2选择性鉴别培养1复习思考题1、克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌）分布较广，抵抗力强，是人和多种动物条件致病菌，危害不大；但对婴幼儿是危害严重的致病菌，能引起严重的新生儿脑膜炎、败血症和坏死性小肠结肠炎,并可能遗留严重的神经系统后遗症,死亡率达50%以上。该菌已被世界卫生组织和许多国家确定为引起婴幼儿死亡的致病菌之一；2004年世界粮农组织和世界卫生组织经过风险性评估将C.sakazakii和肠炎沙门氏菌共同列