dna重组技术在植物寄主线虫分类上的应用

dna重组技术在植物寄主线虫分类上的应用

1线虫新种和分类植物寄生虫昆虫的分类目标是尽可能简单地阐明昆虫的种类、多样性、它们的相互关系和进化历史。为了实现这个目标,各种分类技术随着科学技术的进步而应用到线虫中。纵观植物寄生线虫分类学的发展过程,线虫分类主要以形态学分类为主,兼以生态学及生物学特征。以后,随着电子计算机的发展,把用于形态分类的指标数量化,应用聚类分析法而建立了线虫的数值分类法。电子显微镜的应用促进了形态学的发展,同时也对光学显微镜下的形态分类提出了新的挑战,因为原本在光学显微镜下相似的形态结构,在电子显微镜下差别却很大,而电子显微镜的昂贵的费用和制片过程也限制了它在日常鉴定中的应用。随着线虫学科的发展,愈来愈多的线虫新种被发现,且与原来已鉴定的种从形态上较难区分,另外又由于地理隔离,不同国家的线虫分类学家对同一种线虫定名的同物异名现象时有发生。随着抗线虫育种的发展,对具有严重危害性的植物寄生线虫如短体线虫Pratylenchusspp.、茎线虫Ditylenchusspp.、根结线虫Meloidogynespp.、胞囊线虫Heteroderaspp.、球形胞囊线虫Globoderaspp.、松材线虫Bursaphelenchusxylophilus以及剑线虫Xiphinemaspp.的鉴定提出了更高的要求。由于这些线虫对寄主的侵染存在着明显的侵染专化性,因此对这些种的鉴定必须做到准确无误。由于形态学指标受环境影响较大,为寻求比较客观、准确的鉴定依据,线虫学家用线虫体内的蛋白质或酶的成分为指标,对线虫进行鉴定,因而产生了线虫蛋白质及酶的电泳分类法及免疫学分类法。这些技术被较好地应用于区分根结线虫的几种常见种。DalmassoA等实现了用一条根结线虫雌虫的酶则足以达到鉴定目的,效果相当稳定,已用于日常鉴定中。但是以线虫蛋白质或酶为基础的电泳分类法及免疫分类法只适用于少数几种线虫,且除根结线虫可以用一条线虫作为鉴定依据外,其他种线虫需要提取线虫的酶或蛋白质之后,才能进行鉴定。有些线虫的酶或蛋白质的提取过程比较复杂,且易受植物组织的污染,从而限制了这种方法的使用范围。利用不受环境条件影响的线虫遗传物质DNA对线虫进行分类是于80年代中期,随DNA重组技术的发展而发展起来的,主要用于鉴定经济上比较重要的植物病原线虫如:根结线虫、马铃薯白线虫(G.pallida)、短体线虫、松材线虫及传毒线虫剑线虫等。利用线虫遗传物质DNA重组技术进行分类,依分类目的及所需要的DNA的量,可分为二个阶段。第一个阶段是从大量纯培养线虫中提取DNA,用于进行DNA多态性分析,从而研究线虫的生物多样性及属内或种内变异规律;第二阶段是以单条线虫的DNA为基础,对线虫进行快速、精确鉴定。2启动dns-slat技术用于植物寄生虫线虫的分类2.1rapd技术在非选择性dna片段电泳、染色、聚类分析、鉴定的应用DNA重组技术在线虫的生物多样性及属内或种内变异规律研究中的应用,主要以RFLP及RAPD技术为代表。RFLP技术主要是利用DNA分子核苷酸序列的两个基本特性,首先是它能被具有识别特定碱基片段并在该位点准确将其切断的限制性内切酶精确地切断,然后把这些被切开了的DNA片段在琼胶上进行电泳,把电泳带回收到固体支持物如尼龙膜上或其他支持物上,最后把它们和标记过的DNA探针进行杂交,从而证明不同种线虫的限制性DNA片段的多态性并利用这些多态性对线虫进行区别。这个方法是逐步发展起来的。最早是用被限制性内切酶消解后的基因组DNA片段或线粒体DNA片段直接进行电泳、染色,并在260nm条件下观察电泳结果。由于电泳带太多,结果较难分析。后来用同位素标记的同源或异源的DNA探针和回收的DNA片段进行杂交,使这项技术能够在种间或种内水平上区分不同种的线虫。RAPD技术使用单一一对引物对线虫的DNA进行随机扩增之后,经电泳、染色,并在260nm的条件下观察电泳结果,将不同种线虫的非限制性DNA片段的多态性显示出来,用聚类分析方法对这些片段进行多态性分析,用于种的鉴定及种与种之间的亲缘关系的分析。由于这两种方法一般都需要大量的纯培养线虫提取DNA,因而,在日常使用中受到限制。2.2利用卫星dna探针和pcr引物进行同时鉴定DNA重组技术对单条线虫的精确鉴定,主要是利用线虫染色体DNA的保守区域,如作用不明的卫星DNA及核糖体DNA的非转录(ITS)片段进行鉴定。这两种方法使用特定的卫星DNA引物或ITS引物对线虫DNA通过聚合酶链式反应(PCR),对线虫DNA进行扩增,扩增出相应的卫星DNA片段或ITS片段,对这些片段进行测序,设计合成PCR特异性引物。然后用单条线虫进行PCR反应,得到该种线虫的特异性片段,经过电泳、染色即可看出结果。目前这种方法已经成功地鉴定重要的病原线虫。如PiotteC.成功地用根结线虫卫星DNA的PCR引物把北方根结线虫M.hapla、花生根结线虫M.arenaria及南方根结线虫M.ingonita区分开来,而且还可以区分北方根结线虫的3个地理小种“England”、“Frontignan”及“Lamole”小种。UeharaT.等成功地用ITS特异性引物区分了2种短体线虫P.coffeae及P.Loosi。王新荣等成功地用ITS的特异性引物鉴定了3种剑线虫X.index,X.diversicaudatum,X.viuttenezi等等。现在进一步发展到,在单条线虫DNA的基础上,利用多对PCR引物对一个属的多种线虫进行同时鉴定,如WilliamsonV.M.可以通过1次PCR反应,利用两对PCR引物将北方根结线虫或奇特伍德根结线虫M.chitwoodi从这两种线虫的混合物中,同时鉴定出来。对剑线虫的混合样品的一次PCR鉴定技术正在法国农业科学研究院Antibes研究中心植物健康与环境研究所进行。这大大简化了用DNA重组技术进行线虫分类的程序。在这个基础上,可以发展用化学标记的卫星DNA探针或ITS探针直接和单条线虫进行DNA杂交,并可发展到用常规染色法对线虫进行鉴定。以后还可以开发基因芯片,达到对线虫快速、准确鉴定的目的。目前法国农业科学研究院Antibes研究中心植物健康与环境研究所等实验室正在进行此方面的研究。2.3线虫及线虫到目前为止,DNA重组技术主要用于鉴定重要病原线虫的种及小种,如松材线虫、根结线虫、短体线虫、胞囊线虫、球形胞囊线虫、茎线虫及剑线虫等。在建立植物寄生线虫分类系统上的应用方面,除了对个别种或小种的分类位置进行局部调整外,以该项技术为基础的更高一级分类界元的确定,目前涉及很少。3dna重组技术利用DNA重组技术对线虫进行分类,为解决生产上重要病原线虫的种间及种内水平的准确鉴定提供了强有力的辅助工具。但是,用DNA重组技术对线虫进行鉴定,还处于研究试验阶段,都是先通过形态分类,知道是什么种或相似种之后,再用相应DNA重组技术进行检验。形态学分类以其直观、简单和经济而广泛使用,当种或小种的区别不明显时,才用DNA重组技术进行鉴定。随着科学技术的发展,对某种重要的病原线虫