高脂饲料加小剂量sz诱导的糖尿病大鼠hpa轴与糖脂代谢的关系

高脂饲料加小剂量sz诱导的糖尿病大鼠hpa轴与糖脂代谢的关系

糖尿病（metis）是一种严重的人类疾病，但其病因和发病机制尚不完全清楚。1977年Besedovsky等提出了神经内分泌免疫调节(neuroendocrineimmuno-modulation,NIM)学说,其中心含意是机体的神经系统、内分泌系统与免疫系统相互作用、相互协调、相互制约,共同调节机体的各项机能活动,以保持内环境平衡与稳定,此学说一经提出即引起学者的注意并将其引入对糖尿病发病机制的解释。糖尿病最明显的特点就是糖代谢紊乱,机体通过NIM网络中下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenalaxis,HPA轴)等几个重要的轴将糖代谢直接或间接地联系起来。本文采用高脂饲料加小剂量STZ联合诱导的大鼠糖尿病模型,研究该模型上HPA轴的功能变化及地黄寡糖对其的调节作用。1材料和方法1.1材料表面1.1.1动物合格号清洁级Wistar大鼠,♀,体重180～200g,由兰州大学动物实验中心提供,动物合格证号:SCXK(甘)2009-0004。1.1.2ros、生产、检测试剂与仪器链脲佐菌素(streptozotocin,STZ),Sigma公司;地黄寡糖(Rehmanniaglutinosaoligosaccharides,ROS)由兰州军区兰州总医院全军临床药理基地提供,其中四聚糖占60%、三糖占30%、其余为单糖或二糖;盐酸二甲双胍,中美上海施贵宝制药有限公司,血糖、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)检测试剂盒均购自四川省迈克科技有限责任公司;胰岛素放射免疫分析试剂盒,北京华英生物技术研究所产品;促肾上腺皮质激素(ACTH)、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、皮质酮(CORT)ELISA测定试剂盒为R&D公司产品;其余试剂均为国产分析纯。1.1.3电子天平21半自动生化分析仪,荷兰VitalScientific公司;BP210S电子天平,赛多利斯有限公司;HP-8453紫外分光光度计,美国惠普公司;BiofugeStratos高速台式冷冻离心机,德国Heraeus公司;SN-682放射免疫γ-计数器,中国科学院上海原子核研究所日环仪器厂。1.2实验方法1.2.1stz分次注射糖尿病模型♀Wistar大鼠高脂饲料饲养,高脂饲料的配方为:蛋黄2.5%、蔗糖20%、猪油10%、基础饲料67.5%。以上述饲料饲养2mon后再以腹腔注射(ip)30mg·kg-1STZ诱发糖尿病,STZ注射前大鼠禁食16h。注射STZ7d后测定大鼠血糖,选取血糖值大于15mmol·L-1者纳入实验。大鼠分为正常对照组、糖尿病模型组、ROS给药组(200mg·kg-1·d-1)及二甲双胍给药组(200mg·kg-1·d-1)。正常对照组及糖尿病模型组给予等量蒸馏水。以上各组均为灌胃(ig)给药,每周测定1次血糖和体重,连续给药4wk后使用代谢笼(metaboliccages)收集尿液,并在末次给药后大鼠禁食不禁水6h断头处死并收集躯干血,4000r·min-1,4℃离心10min,将血浆分装于不同的离心管中-20℃保存待用。1.2.2大鼠血糖、尿糖、血脂和肝糖原的测定血糖及血脂按照试剂盒说明书进行操作测定,肝糖原采用蒽酮比色法测定。1.2.3胰岛素、crh、活动和皮质酮的测定胰岛素采用放免法测定,CRH、ACTH及皮质酮采用夹心ELISA测定,24h尿液中皮质酮总量=尿液中皮质酮浓度×尿液体积。1.3统计处理使用SPSS11.5统计软件,各组实验数据均用x¯±sx¯±s表示,组间差异的显著性用t检验进行统计学处理。2结果2.1大鼠肝糖原-血脂指标的变化大鼠给药4wk后地黄寡糖组(ROS)组和二甲双胍组的血糖较模型组均明显下降(P<0.05),其中ROS组较模型组下降达14.4%(Fig1)。给药4wk后模型组大鼠较正常对照组尿液中葡萄糖浓度增加了25.4倍(P<0.01),ROS组和二甲双胍组较模型组下降较明显(P<0.01,Fig2)。模型组大鼠肝糖原含量与正常组相比下降明显并具有统计学意义(P<0.05),ROS和二甲双胍虽能提高肝糖原含量,但未见统计学意义(Fig3)。糖尿病模型组大鼠的总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)含量与正常组相比均有所升高,高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)则有所下降,其中TC、HDL-C变化具有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。ROS组与模型组相比可以提高血浆中HDL-C的含量,差异具有显著性(P<0.05),二甲双胍有逆转这种变化的趋势,但差异未见显著性(Fig4)。2.2大鼠体内crh、tt-qp、fg1的变化模型组大鼠与正常组相比胰岛素下降明显(P<0.05),ROS组与二甲双胍组胰岛素水平较模型组均有所提高。血浆中CRH各组变化均无显著性。模型组血浆中ACTH和皮质酮较正常组升高(P<0.05),ROS和二甲双胍可以逆转这一趋势,并具有统计学意义(P<0.05,Fig5)。模型组大鼠下丘脑CRH的含量比正常组降低了58.17%(P<0.05),ROS组和二甲双胍组均有升高CRH的趋势,但未见统计学意义。垂体中ACTH含量模型组最高,比正常组高49.91%(P<0.05),ROS组和二甲双胍组都有所降低(P<0.05)。24h尿液中皮质酮模型组最高(P<0.01),ROS和二甲双胍都有逆转这一趋势的作用(P<0.05,Fig7)。3糖尿病大鼠血糖和血脂指标的变化糖尿病是常见病多发病,但对于其发病的机制尚未完全阐明。神经内分泌免疫调节网络不仅对维持机体内环境平衡起重要作用,而且参与衰老、应激等病理生理过程的调节。有证据表明糖尿病的发病与神经内分泌免疫网络尤其是HPA轴的紊乱有关。HPA轴是神经内分泌免疫调节网络中一个重要的反馈调节系统,参与糖代谢调节。HPA轴的功能改变在糖尿病的发生、发展中可能具有重要作用。本实验结果表明高脂饲料加小剂量STZ联合诱导的糖尿病模型糖脂代谢发生了紊乱,而且HPA轴也发生了变化。糖尿病模型组大鼠垂体中ACTH的含量明显高于正常对照组(Fig6),垂体产生的ACTH分泌进入血液使血浆中的ACTH浓度升高(Fig5),ACTH升高可进一步促使肾上腺皮质分泌皮质酮,从而使血液中皮质酮升高,过高的皮质酮通过尿液排出体外,这样就会使大鼠24h皮质酮排出量远大于正常组(Fig7),虽然尿液中皮质酮浓度与正常对照组差异并无显著性,但糖尿病大鼠24h尿液排泄量是正常大鼠的十几倍甚至上百倍。糖尿病大鼠的肾上腺指数也大于正常大鼠,这可能由于ACTH刺激皮质酮分泌细胞过度增生的结果。CRH是促进垂体分泌ACTH的主要物质,但实验结果显示糖尿病模型血浆中CRH与正常对照相比并没有明显变化(Fig5),这可能是由于血浆中高浓度的ACTH和皮质酮负反馈抑制了CRH的分泌使血浆中CRH趋于正常。实验结果还显示下丘脑中的CRH较正常大鼠有所降低(Fig6),这主要是由于下丘脑视旁核分泌的CRH并不是血浆CRH的唯一来源,研究表明外周组织如胰腺、肾上腺和小肠也是血浆CRH的重要来源,下丘脑分泌的CRH只占血浆CRH的一小部分。本实验所采用的糖尿病模型是高脂饲料加STZ联合诱导的,由于STZ可特异性损害胰腺β-细胞使胰岛素的分泌减少从而使血糖升高。因此推测此模型可能是血糖先升高然后HPA轴的活性再升高。二甲双胍通过促进外周组织对葡萄糖的利用从而降低糖尿病大鼠血糖(Fig1),HPA轴的激素(ACTH、CRH)也相应有所下降(Fig5,6)。因此,HPA轴的活性很可能是随着血糖的降低而降低的。但是Chan等用根皮苷(一种增加尿葡萄糖排泄的化合物)治疗糖尿病大鼠,能使糖尿病大鼠空腹血糖正常,但餐后血糖仍轻度升高,但它不能使糖尿病大鼠的HPA轴活性恢复到正常,这强烈提示慢性高血糖本身不是糖尿病大鼠HPA轴活性上调的原因。HPA轴活性的升高会产生大量的皮质酮从而使血浆中皮质酮升高,皮质酮过高会促进脂肪分解、糖原异生和减少细胞对葡萄糖的摄取,从而削弱胰岛素的作用,升高血糖,造成或加重组织胰岛素抵抗,使糖代谢紊乱难以控制。由此可见,我们诱发的糖尿病模型血糖升高和HPA轴活性的增加是相互促进的,这使得糖尿病病情进一步