2型糖尿病大鼠模型的建立及胰岛素敏感性评估

2型糖尿病大鼠模型的建立及胰岛素敏感性评估

胰岛素分泌缺陷和胰岛素抵抗是2型糖尿病的主要病理生理基础和显著特征，导致体内葡萄糖和脂质代谢紊乱。建立较为理想的具有胰岛素抵抗特征的2型糖尿病动物模型,并将其用于糖尿病的中医药研究中,能够更有效、科学地评估中医药对糖尿病的治疗作用。目前实验研究中所用的动物模型大多是用化学药物(链脲佐菌素Strepozotocin或四氧嘧啶Alloxan)破坏胰岛β细胞所致的糖尿病大鼠模型,其胰岛素分泌缺乏的特点与2型糖尿病的病理特征和临床特点不符;而高脂饲料喂养可以造成大鼠的广泛胰岛素抵抗,但其血糖水平可以维持正常。我们运用高脂饲料喂养结合小剂量链脲佐菌素(STZ,Streptozotocin)一次性腹腔注射的方法,成功地制作出2型糖尿病的大鼠模型,并运用正常血糖-高血浆胰岛素钳夹技术结合大鼠股四头肌放射性GUR的测定,对胰岛素抵抗进行评估。1材料和方法1.1动物中心提供雄性Wistar大鼠,体重在200~250g,周龄8周,由南京中医药大学实验动物中心提供。标准饲料:蛋白质占23%,碳水化合物占53%,脂肪占5%;高脂饲料:在10000g标准饲料中加入150g食盐、50g白糖、2000g猪油、400g麻油、2000g花生、鸡蛋900g,碳水化合物48%,脂肪22%,蛋白质20%。1.2大鼠的一般情况1.2.1主要试剂胰岛素放射免疫分析盒:北京福瑞生物工程公司生产,批号:0003;甘油三酯(TG)试剂盒:上海荣盛生物技术有限公司生产,批号:000310;血清游离脂肪酸(NEFA)试剂盒:南京建成生物工程研究所生产,批号:20010221;胰岛素:美国Lilly公司生产,浓度40U/L;2-DEOXY-D-GLUCOSE-3H,产地:美国SIGMA公司,批号:031K9456。1.2.2设备微量血糖测定仪:美国罗氏公司生产;UV-754型分光光度计:上海分析仪器厂生产;WIZARD1470型全自动γ计数器:芬兰医学放免仪器公司;微电脑针筒输注泵:美国FISHER公司生产;大鼠恒温手术台:南京六合生理生化仪器厂生产;GL-20型全自动高速冷冻离心机:上海医学仪器厂生产;L8-80m型低温超速离心机:美国Beckman公司生产;液体闪烁仪:美国Beckman公司生产。1.2.3造模方法与标本采集Wistar大鼠,适应性饲养1周,称体重,随机抽出16只,为正常组,喂以标准饲料。余下大鼠喂高脂饲料,4周后,按25mg/kg体重的剂量一次性腹腔内注射STZ(溶于0.1mmol/L柠檬酸缓冲液,pH4.4),2周后,大鼠禁食12h后,按2g/kg体重灌喂20%D-葡萄糖溶液,做口服糖耐量试验,凡0和120min血糖分别大于7.0和11.0mmol/L的大鼠,取最高值的16只大鼠作为糖尿病组,继续喂以高脂饲料4周。每周称体重。4周后,禁食12h,2组中的各8只大鼠用于检测空腹血糖、葡萄糖耐量、血清游离脂肪酸、甘油三酯、血浆胰岛素含量;另8只大鼠进行正常血糖-高血浆胰岛素钳夹试验。1.2.4胰岛素敏感性指数的计算参照李光伟等方法,为空腹血糖与胰岛素乘积的倒数,因为非正态分布,分析中取其自然对数,并以正常大鼠为对照组,计算相对胰岛素敏感性。1.2.5正常血糖-高血浆胰岛素钳夹技术检测动物模型胰岛素敏感性参照DeFronzo的方法进行改进,实验大鼠,禁食不禁水12h后,以2.5%戊巴比妥钠注射液50mg/kg体重腹腔注射麻醉。仰位固定于大鼠恒温手术台上,保持体液温度在37℃左右,采用美国进口PE50导管,管腔中预先注入50U/ml的肝素生理盐水溶液抗凝,进行双侧股静脉和右侧颈动脉插管,右股静脉导管连接微电脑注射泵输注葡萄糖,左股静脉导管连接微电脑注射泵恒速输注胰岛素,右颈动脉导管连接注射器以取血样。先测定基础血糖值(BBG),然后以4mU/(kg·min)恒速输注胰岛素,和6mg/kg·min-1.输注10%葡萄糖溶液,5min后取血测定血糖值,调整葡萄糖输注率,维持在BBG±0.5mmol/L的范围,每5min测定血糖1次,当连续3次血糖值均在上述范围时,即达到稳定状态。达到稳态后,每5min再取血测血糖,记录稳态下最后6次GIR的平均值作为GIR。1.2.6大鼠股四头肌GUR的测定在正常血糖-高胰岛素血钳试验的同时进行。输注胰岛素开始75min后,一次性给予20微居里的3H-2D葡萄糖(3H-2DG,1mCi/ml,取1ml用生理盐水稀释为10ml,取0.2ml即得20μCi),45min后处死实验大鼠,在10s内,分离出大鼠的股四头肌,并立即放入液氮中冷冻,然后把样本存放在-70℃冰箱,备查肌组织中3H-2DG活性。测定时称取1g股四头肌,剪碎,加入5ml生理盐水,研磨肌组织,离心取上清液,放入含5ml闪烁液(选用3H标准专用闪烁液:1000ml二甲苯溶液加入PPO4g,POPOP0.4g)的杯中,用液体闪烁仪计数1min3H-2DG放射性活性数值(cpm)即为骨骼肌GUR。1.2.7统计数据采用(x¯±s)(x¯±s)表示,组间差异采用t检验。统计软件是SPSS软件包。2结果2.1延伸性增加2组大鼠的起始体重没有差异,实验期间体重随着时间的延伸规律性地增加。造模组大鼠的体重增加较快,从第三周起,与正常组大鼠比较出现差异,差异逐渐增大直到实验结束。见表1(仅显示了双周的体重)。2.2各组大鼠血糖、血糖的比较实验结束时,模型组空腹血糖和餐后2h血糖明显高于正常组大鼠,有显著的统计学差异,显示了糖尿病模型组大鼠的空腹血糖增高和糖耐量明显减低,见表2。2.3大鼠胰岛素敏感性比较检测实验大鼠的空腹血浆胰岛素和空腹血糖并计算胰岛素敏感性指数,显示了模型组的大鼠空腹血浆胰岛素、空腹血糖水平均高于正常组大鼠,而胰岛素敏感性明显低于正常组大鼠。见表3。4甘油三酯(TG)和游离脂肪酸(FFA)甘油三脂、游离脂肪酸浓度检测显示模型组大鼠明显增高,与空白组相比,具有显著性差异。见表4。5正常血糖-高血浆胰岛素钳夹技术对2组大鼠的胰岛素敏感性的评价正常血糖-高血浆胰岛素钳试验和股四头肌3H-2DG的cpm测定显示模型组大鼠GIR和股四头肌GUR均显著下降。3型糖尿病大鼠模型胰岛素分泌缺陷和胰岛素抵抗是2型糖尿病的主要病理生理基础和显著特征,导致体内葡萄糖和脂质代谢的紊乱,所以良好的2型糖尿病动物模型应具备这2方面的特性。多年来,在研究中医药治疗糖尿病中,多以药物(链脲佐菌素或四氧嘧啶)损伤大鼠的β细胞而制作动物模型。这类模型,大量β细胞被破坏,表现出明显的多饮、多食、多尿、消瘦和高血糖,严格意义上说更符合1型糖尿病的特征,与2型糖尿病的病理特征和临床特点不符,而且造模动物的存活率低。近年来,国外研制出多种具有胰岛素抵抗自发性糖尿病动物,如ZDF大鼠、GK大鼠、OLETF大鼠等。这类动物是2型糖尿病研究良好的模型,但是,其价格昂贵,饲养与繁殖条件相对严格。研究表明,高脂饲料喂养可以引起大鼠广泛的胰岛素抵抗,再加上小剂量多次注射链脲佐菌素造成胰岛β细胞轻度损伤,使多数动物产生糖耐量异常,再喂以高热量饲料引起动物肥胖,也可以制作出糖尿病的大鼠模型。本实验先以高脂饲料喂养,再加小剂量一次腹腔注射链脲佐菌素制作的大鼠模型,表现出肥胖、高血糖伴有高血脂、高胰岛素血症及胰岛素抵抗,与2型糖尿病的特征一致。由于胰岛素抵抗是2型糖尿病重要的病理特征,胰岛素抵抗的水平的判定是2型糖尿病动物模型是否成功的关键。高胰岛素正常血糖钳夹技术测定葡萄糖代谢率被公认为研究胰岛素抵抗的金指标,1993年国内李氏引入了一个新的胰岛素敏感指数(空腹血浆胰岛素与血糖乘积的倒数,并证实与正常血糖胰岛素钳夹技术测定的胰岛素敏感性指数(胰岛素介导的葡萄糖代谢率)显著相关。胰岛素抵抗多发生在骨骼肌、脂肪和肝