应用聚合酶链反应和双链异源泳动分析技术对血友病甲遗传咨询的比较研究

应用聚合酶链反应和双链异源泳动分析技术对血友病甲遗传咨询的比较研究

血液中的友病性疾病是由人类由于凝血因子基因缺陷引起的x射线衍射障碍引起的隐形疾病。20世纪80年代以来利用因子Ⅷ基因内和基因旁限制性内切酶片段多态性(RFLP)进行连锁分析是国内外血友病甲基因诊断和产前基因诊断的重要技术方法。但由于突变类型的不同RFLP连锁分析的使用有一定的局限性。随着聚合酶链反应(PCR)技术在基因诊断中的广泛应用,长距离扩增凝血Ⅷ因子基因对重型血友病甲的基因诊断获得重大突破。但对于其他突变类型的血友病甲基因诊断仍需进一步的探索。20世纪90年代,发现人的FⅧ基因13号内含子高可变二核苷酸重复序列在不同人群中的多态性,并且已经引入到血友病甲的基因诊断研究中,为探索一种更简便,更特异的血友病甲的基因诊断方法。我们对10例血友病患儿及其家系中成员,男性20例,女性10例,共40条X染色体的凝血Ⅷ因子内二核苷酸重复序列的多态性进行了研究,报告如下。对象和方法一、sds的制备本组共10例血友病甲患儿(男)(均经人民医院临床血液学检验诊断为血友病甲),家系成员20例(男10例,女10例)及无关成年女性2例取外周抗凝血2ml,三蒸水低渗破碎红细胞,2000r/min,10min离心收集白细胞,PBS反复洗两次,加0.5ml细胞裂解液(15mmol/LTris-HCL,pH8.0,0.15mmol/LEDTA,15mmol/LNaCl),1/10体积的10%SDS,50μg/ml蛋白酶K混匀,37℃过夜,次日,酚-氯仿法抽提,无水乙醇沉淀DNA,室温干燥,溶于50μl无菌三蒸水中,4℃贮存备用。二、taq酶pcr扩增PCR试剂盒购自华美生物技术公司。TakaRa生物技术公司合成引物,序列如下:A1:5′-TGCATCACTGTACATATGTATCTT-3′A2:5′-CCAAATTACATATGAATAAGCC-3′PCR反应50μl反应体系含1μgDNA模板,引物A1,A2各10pmol/L,2.5单位Taq酶,10mmol/LdNTP,反应条件为95℃变性5min,94℃45s,55℃45s,72℃60s,30个循环。取5μl扩增产物,1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。三、rss-lnacl-tis-hcl的聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳取10μl患者PCR扩增产物,10μl同一家系母亲PCR扩增产物,2.2μl10×异源双链杂交液(1mol/LNaCl,100mmol/LTris-HCl,pH7.8,20mmol/LEDTA,pH8.0)混匀,沸水煮5min,快速放入冰浴中,放置20min,分别加入上样Buffer4μl,在8%的聚丙烯酰胺凝胶上,1×TBE电泳Buffer,250V电压电泳3h,电泳完毕,于0.5μg/ml溴化乙啶中染色1h,紫外灯下观察结果。结果一、凝血f因子13内含子的can二核苷酸重复序列及扩增产物的鉴定10例血友病甲患儿及其家系中成员30个DNA样品和2例无关女性的DNA样品,PCR扩增凝血FⅧ因子13内含子的(CA)n二核苷酸重复序列,其扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳,所有样品均可见长约140～150bp多DNA片段(图1)。男性呈现单一的DNA条带,女性则根据不同的等位基因可出现两条或者一条DNA条带。二、10家系中can的获得和赔偿根据图1电泳显示凝血Ⅷ因子基因中13内含子重复序列长度的多态性,对10例血友病甲家系进行等位基因连锁分析。10个家系中(CA)n的拷贝数均为20～23。10例患儿的(CA)n拷贝数均与母亲两条X染色体中一条(CA)n的拷贝数一致,即母亲为携带者。10例患儿中8个为杂合子,2个为纯合子,经过(CA)n多态性的连锁分析,可以鉴别出Ⅷ因子异常基因的携带者。三、同源双链的dna电泳血友病患者的重复序列扩增片段与家系中隐性携带者的扩增片段经异源双链杂交,于8%聚丙烯酰胺凝胶电泳,形成异源双链的DNA条带,或同源双链的DNA条带,同源双链的泳动速度快于异源双链。同源双链泳动在前,异源双链泳动在后(图3)。电泳结果显示了双链dna的重复序列,特点就是表现在体我们对10例血友病甲患儿及其家系,其中包括10个女性,20个男性,共40条X染色体DNA样品,分别扩增了凝血因子Ⅷ基因13内含子(CA)n的重复序列,经1%琼脂糖凝胶电泳,男性样品均呈现出单一的DNA条带,女性可呈现一条或两条DNA条带。如果来自母亲的一条X染色体和来自父亲的一条X染色的(CA)n重复数目相同时,电泳在同一位置上,则显示出一条带。这种情况在10例女性DNA样品中,有2例。如果两条X染色体(CA)n的重复数目不同时,电泳则出现两条带。本研究结果证明了二核苷酸重复序列广泛存在于血友病甲的患儿及其家系的基因组中,其重复数目在20到23之间,结果与国内文献曾报道的一致。异源双链泳动分析中,血友病患者的DNA扩增产物与母亲的DNA扩增产物经变性、退火、异源杂交,8%聚丙烯酰胺凝胶中140～150bp处都可见到一条同源的双链DNA杂交带,结合血友病甲家系等位基因连锁分析可明确鉴别出血友病甲家系中有病基因的携带者。此法用于鉴别血友病甲的有病基因的携带者或产前遗传病咨询,与传统使用的RFLP连锁分析相比,具有准确,简便、快速的特点。由于二核苷酸重复序列稳定地存在于人类基因组中,作为第二代的遗传标志,可用于遗传病的基因分析。在我们分析的群体中,13内含子