2型糖尿病免疫模型的建立

2型糖尿病免疫模型的建立

糖尿病是一种尚未完全确定病因和发病机制的临床综合征。目前发现与遗传、环境、免疫等因素密切相关。之前的研究一直围绕高血糖的糖毒性进行的,最近有学者提出2型糖尿病的发病机理涉及免疫损伤,且可有多个器官受累,关于2型糖尿病免疫改变的临床研究已经有许多报道,但是实验动物方面的研究报道很少。为了研究2型糖尿病与免疫的关系,建立相应的动物模型是研究糖尿病免疫机制的重要手段之一。目前建立糖尿病免疫动物模型的方法较少,有实验性糖尿病动物模型、自发性糖尿病动物模型和转基因糖尿病动物模型等。其中,实验性糖尿病动物模型是目前最常用的方法。本研究旨在介绍采用链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导构建2型糖尿病免疫动物模型的方法,我们试验小组尝试在注射STZ之后普通饮食喂养1个月,意在观察长时间的高血糖的刺激对大鼠免疫器官及体液免疫的影响。为以后糖尿病免疫方面的研究提供实验动物模型的依据。无特定病原体(SPF)级雄性(Wistar)成年大鼠40只,体重160～200g,哈医大实验中心提供,随机分为2组:对照组和实验组各20只。所有大鼠均以标准颗粒饲料、标准笼喂养,每笼10只。各组大鼠实验期间均自由进食、饮水。自然昼夜照明,室内通风良好,相对湿度为50%～70%,室温保持在22～24℃。STZ粉针剂:Sigma公司生产;稳豪型(OnetouchUltra)血糖仪及试纸,美国强生公司;ELISA试剂盒。两组大鼠适应性喂养1周,实验组给予高糖高脂饲料(由2.5%胆固醇、5%蛋黄粉、10%猪油、20%蔗糖、62.5%基础饲料等组成)。高糖高脂饲料喂养4周后,腹腔注射STZ(临用前溶解在pH=4.2的0.1mmol/L柠檬酸缓冲液内,配置成1%浓度的STZ,35mg/kg,1次/d),对照组普通饲料喂养4周,再注射等量柠檬酸缓冲液,1次/d。注射药物3天后,测大鼠空腹血糖(测试前禁食12h),以血糖含量16.7mmol/L以上为大鼠2型糖尿病模型造模成功的判定标准。造模成功的大鼠给予普通饲料喂养4周,对照组也普通饲料喂养4周。4周后,各组大鼠眼球取血,做生化及免疫指标。解剖取胸腺做病理。免疫指标和病理出现免疫改变的为大鼠2型糖尿病免疫模型造模成功的判定标准。一般状况:包括大鼠的精神状态、体重、饮水量、食量、大小便等。血糖测定:腹腔注射STZ,空腹喂养4周后,进行空腹状态下针刺尾尖取血,测其血糖值。空腹血清胰岛素(FINS):血清白介素-2(IL-2)测定、血清白介素-6(IL-6)测定,于末次给药后禁食水12h,摘眼球采血,并按ELISA试剂盒方法操作。胰岛素敏感系数(ISI):采用李光伟等引进的方法,即FBG与FINS(空腹胰岛素值)乘积倒数的自然对数,ISI=Ln[1/(FINS×FBG)]。(Ln:自然对数)胸腺指数计算:将各组大鼠的胸腺称重。计算胸腺指数公式:胸腺指数=胸腺重量(mg)/体重(g)。HE染色光镜下观察胸腺组织。采用SPSS11.5统计软件对实验数据进行处理,数据以均数±标准差的形式表示,用t检验分析。2患者体重、血糖变化对照组大鼠皮毛干净,有光泽,生长良好,体重持续增加,精神状况良好,动作自如,反应灵敏,无其他症状。实验组大鼠在注射STZ后皮毛发黄、晦黯,体重逐步较前下降、消瘦走势,观察发现有多饮、多尿、多食、尿膻味加重、大便溏,精神萎靡,动作迟缓,毛枯黄稀少,拱背蜷卧,尿液有明显烂苹果气味。对照组20只,空腹血糖(3.82±0.48)mmol/L;实验组20只,空腹血糖(28.61±4.26)mmol/L。实验组大鼠注射STZ后空腹血糖增高,与对照组比较,有统计学差异,P<0.01。2.3两组胸径指数的比较实验组空腹胰岛素降低,胰岛素敏感指数下降,与对照组比较,有统计学差异。见表1。对照组20只,胸腺指数1.42±0.16;实验组20只,胸腺指数0.25±0.05。实验组胸腺指数降低,与对照组比较,有统计学差异,P<0.01。2.5小球砂受叶发育的灰黑细胞,细胞形态不清,小体皮质。请看实验组IL-2降低、IL-6升高,与对照组比较,有统计学差异。见表2。(1)对照组:胸腺被膜较薄,皮质较厚,含有大量密集的胸腺细胞,小叶间隔分割不完全,间隔较小,相邻小叶的髓质相连,皮质髓质分界清楚。见图1。(2)实验组:胸腺被膜较厚,胸腺小叶较小,皮质髓质分界不清,结构紊乱,皮质和髓质均较空白组明显变薄,小叶间隔较大,分割完全,相邻小叶的髓质不相连,纤维组织增生明显。见图2。3型糖尿病免疫异常模型建立2型糖尿病免疫异常模型的目的在于模拟糖尿病免疫异常的发病因素、病理过程和临床特征,研究糖尿病免疫异常的发病机制及防治方法。本实验采用成年Wistar大鼠高糖高脂饲料喂养一段时间后产生胰岛素抵抗,给予小剂量的STZ,再给予普通饮食一段时间,诱导出病理、生理改变都接近于人类2型糖尿病免疫异常的实验动物模型。该模型具有很多与人2型糖尿病免疫异常发病早期相类似的生化特征及临床表现,因此可用于人2型糖尿病免疫异常发病机制的相关研究,也可用于胰岛素敏感性调节的细胞机制的研究,是一种较为理想的2型糖尿病免疫异常的实验动物模型。但是糖尿病免疫模型还待进一步的探索与研究,我们课题小组也会进一步的改善研究的方法,以更好的为动物实验模型研究和