农杆菌转化杉木愈伤组织的条件优化

农杆菌转化杉木愈伤组织的条件优化

楠木是世界著名的热带树种。它生长迅速，材料齐全。广泛应用于土木工程、桥梁、建筑、高级家具、高端汽车、雕塑、贴纸板、平额板等。柚木也是我国热带地区的主要造林和经济树种,我国9省60多个县(市)有引种栽培,总面积约2万多hm2。我国的柚木栽培经常受到土壤酸性、低温冻害、锈病、台风、野螟等问题的困扰,必须加强常规育种,选育适合于各种立地条件的种源、家系和无性系。同时,在常规育种的基础上,开发柚木的转基因技术,研制抗寒、抗虫、抗病、速生的转基因新品种,对于我国柚木的推广栽培也具有重要意义。从叶盘、茎段、胚轴、子叶等外植体上诱导愈伤组织,转化愈伤组织,并再生出转基因植株一直以来是植物转基因的重要方法。本文优化了柚木茎段愈伤组织的农杆菌转化条件,为柚木转基因技术研究和转基因育种奠定基础。1材料和方法1.1现代愈伤组织外植体基因参数的优化采用无性系试管苗的茎段进行愈伤组织诱导,以愈伤组织连同茎段一起做外植体进行转基因参数的优化。农杆菌则采用含有双元载体pTiBO542和pBI121的常用菌株EHA105。1.2测试方法1.2.1诱导愈伤组织的诱导取具有4-5对叶片,高度为6-8cm的无菌试管苗,切取长度为1.2-1.5cm、不带腋芽的茎段,平放在MS+BA0.5mg·L-1的培养基表面,于26-28℃诱导茎段的两端产生愈伤组织。1.2.2工程农杆菌接种繁殖先从-80℃低温冰箱中取出保存的农杆菌,涂LB培养基平板,挑取单菌落,进行2mL的小体积LB液体培养,再按1∶40的比例接种,进行100mL的大体积液体培养繁殖工程农杆菌。平板培养基和液体培养基附加50mg·L-1的卡那霉素。平板培养、液体培养、共培养的温度均为25-27℃。液体培养的转速为180r·min-1。以4000r·min-1离心收集农杆菌,并用柚木愈伤组织诱导的液体培养基重新悬浮,再用于接种和共培养。1.2.3酶活剂光密度试验,2.预培养时间试验设置7、9、11、13、15、17d6种处理;共培养时间试验设置3、5、7、9、11d5种处理;共培养pH试验设置6.2、6.0、5.8、5.6、5.4、5.2、5.0七种处理;菌液光密度试验设置0.3-0.4、0.4-0.5、0.5-0.6、0.6-0.7、0.7-0.8、0.8-0.9六种光密度处理,因菌液光密度难以控制且测定光密度烦琐费时,实际处理的光密度略有偏离试验设计。采用7813、7557、108和8301四个无性系进行农杆菌转化敏感性测定。外植体取材部位试验选取每个芽苗最长的3节,分上、中、下3种部位处理进行试验。接种时间试验设置浸泡5、15、25和35min4种处理。卡那霉素试验设置0、5、10、15、20、25mg·L-16种处理。1.2.4增加2.3瓶数所有试验的每个处理重复8瓶,每瓶6个茎段,共48个重复。由于实际操作中存在一定的污染率,每个处理比预定的重复瓶数增加2-3瓶,以确保每个处理到调查时有足够的瓶数。如果没有污染,多余的瓶数则随机去除。1.2.5酒精的染色参照文献的方法,预培养和共培养结束后即进行GUS染色,染色温度为37℃,时间为24h。染色后,无水酒精褪色48h,每12h换1次新鲜酒精。在实体显微镜下放大40倍观察,统计蓝斑的数量。1.2.6组织故伤组织造成的死亡调查指标有愈伤组织蓝斑数、茎段表皮蓝斑数、愈伤组织颜色、愈伤组织重量、愈伤组织死亡率和茎段外植体死亡率等。正常的柚木愈伤组织为白色、淡绿色或淡黄色,愈伤组织变成黑褐色和水浸状时视为死亡。正常茎段的表皮颜色为绿色或淡绿色,茎段变成深黄色或褐色时视为死亡。2结果与分析2.1eha105对愈伤组织的生长和转化的影响外植体预培养时间是农杆菌转化植物细胞的重要技术参数之一,预培养使得外植体的细胞处于旺盛的细胞分裂和生长状态,从而容易被农杆菌转化。从表1可以看出,愈伤组织的蓝斑数量从预培养7d的3.3个·茎段-1,逐渐增加至11d的9.33个·茎段-1,13d的蓝斑数量达到最大值,而超过15d,蓝斑数量呈下降趋势。EHA105转化柚木愈伤组织时以预培养11-13d为佳。愈伤组织的有斑率从7d的26.67%升至11d的53.33%后则基本稳定在52.0%-53.2%。除转化愈伤组织外,EHA105还转化茎段的表皮细胞,平均每个茎段的表皮蓝斑数为1.53-3.57个。随着预培养时间的增长,茎段表皮细胞的转化效率呈明显下降趋势,可能是茎段的内部营养逐渐用于形成愈伤组织,活力逐渐下降的缘故。共培养过程中,也发现随着预培养时间的延长和愈伤组织的萌发与增大,茎段表皮由绿色逐渐转变为淡绿色或浅黄色。2.2接种市场生长不稳定因素,易感染关注蓝斑、拟被接种者接种浸泡时间过短,农杆菌尚未接触或接种到外植体表面,共培养时无农杆菌生长,不能转化。接种浸泡时间过长,外植体常因农杆菌毒害而软腐。EHA105转化7552愈伤组织时,接种时间为5-25min,愈伤组织的蓝斑数量逐步提高。因此,适宜于柚木愈伤组织转化的接种时间约为25min。2.3商业资源中愈伤组织蓝斑的检测共培养时间也是农杆菌转化植物细胞的重要技术参数之一。农杆菌接受植物信号、切下T-DNA、包装T-DNA、穿过植物细胞壁和细胞膜、通过细胞质进入细胞核、并整合到染色体上至少需要16h。因细胞结构的差异、释放的受伤信号强弱不同、忍受农杆菌危害的能力不同,不同植物最适宜的共培养时间差异比较大。7557愈伤组织与EHA105共培养的时间少于5d时,愈伤组织蓝斑数低于0.5个·茎段-1,共培养9d时愈伤组织蓝斑数升至最大值,但超过11d蓝斑数量开始下降。因此共培养天数以7-9d为好,茎段愈伤组织蓝斑数量最多,愈伤组织有蓝斑的百分率也最高。农杆菌EHA105对茎段表皮细胞的转化也需要5d以上,3d共培养时间则茎段表皮极少有蓝斑。共培养时间过长,农杆菌过度生长,植物细胞因遭受农杆菌毒害而死亡。7557茎段与EHA105共培养5d,愈伤组织即有6.3%的死亡率,茎段死亡率为12.5%,共培养10d后愈伤组织死亡率达到12.3%,茎段死亡率达到17.9%,共培养15d后愈伤组织死亡率达到28.1%,茎段死亡率则高达50.0%。因此,EHA105的生长和侵染对柚木愈伤组织和茎段具有一定的毒性,共培养时间应少于10d。2.4茎段愈伤组织蓝斑数的方差分析EHA105对7813无性系愈伤组织的转化效率随pH值的减小而降低,pH值低于5.6时转化效率显著下降。茎段愈伤组织蓝斑数的方差分析结果显示,pH值为6.0-6.2差异不显著,但显著高于pH值为5.0-5.6。因此,适宜于EHA105转化柚木愈伤组织的共培养pH为6.0-6.2。EHA105对茎段表皮细胞转化则需要低的pH值为5.0-5.4。适宜于EHA105转化表皮细胞的pH值与转化愈伤组织的pH值有明显的差异。2.5d400nm处于对数生长期的农杆菌转化效率最高,但对数生长初期的菌液浓度比较小,农杆菌个体数量不足。光密度是菌液浓度的最好指标,当菌液光密度D600nm小于0.3时,农杆菌个体数量不足。光密度超过1.0后,培养基的养分和氧气供应不足,农杆菌菌液中死亡个体的比例增加,多数情况下不适宜于转化。EHA105转化7552的结果表明,光密度为0.392-0.505,茎段愈伤平均蓝斑数比较高,愈伤组织有蓝斑率也高,为适宜的菌液浓度范围。茎段表皮细胞的转化率则在光密度为0.392-0.685均比较高。2.6ph对苗木诱导的的影响不同基因型或无性系对农杆菌的侵染具有不同的敏感性。EHA105对7813、108和7531三个无性系愈伤组织具有较高的转化效率,而茎段表皮细胞的转化频率则比较低。与其它3个无性系相反,7557愈伤组织的转化效率低,而茎段表皮细胞的转化效率高,蓝斑数量显著高于其它3个无性系。因此,不同无性系对农杆菌的侵染和转化有不同的敏感性,应选择敏感的无性系开展柚木转基因研究。柚木组培苗的个体比较大,高度可达7-8cm,节数4-5个。中间3节的长度最大,占整个苗木高度的85%以上。选取每个芽苗最长3节进行转化,结果表明,上、中、下3节的愈伤诱导率、愈伤组织转化率和茎段表皮细胞转化率均有明显的变化趋势。上部茎段容易诱导出愈伤组织,两端的愈伤组织诱导率均比中、下部茎段高,下部茎段两端的愈伤组织诱导率均最低。另外,3种茎段均容易在基部方向的下端形成愈伤组织,下端的愈伤组织诱导率为67.5%,而上端则仅有31.66%。茎段取材部位对转化效率的影响趋势也比较明显。上部茎段的愈伤因诱导率、愈伤组织转化率、平均蓝斑数均最高,中部茎段居中,下部茎段最低。然而,表皮细胞的转化效率却相反,下部茎段最高,上部茎段最低。3优化参数下的转化条件在植物外植体的转化过程中,共培养时间长、农杆菌过度生长会对植物细胞产生毒害作用,导致植物组织的死亡和转化效率的降低。水稻、棉花、马铃薯、黄瓜、西瓜、甜瓜、烟草、甘薯、苜蓿、亚麻、花生、豌豆、生菜等许多农作物的最适共培养时间为2-6d,桉树、木麻黄、杨树、白桦等多数林木也是3-6d[11,12,13,14,15,16]。柚木愈伤组织对农杆菌的过度生长和毒害具有一定的耐性,与EHA105共培养的适宜时间为7-9d,比常见植物种类的2-6d多2-3d。pH值对农杆菌Vir区基因的活化和表达有显著的影响,当培养基的pH低于6.0时比较适宜于农杆菌Vir基因的诱导表达,pH值为5.1-5.8时Vir基因的诱导达到最高水平。柚木是一种不耐酸性的树种,土壤的pH值为6.5左右时最适宜于生长。柚木外植体的愈伤组织诱导和增殖培养适宜的培养基pH值也比较高,为6.0-6.4。因此,选择合适的共培养pH值,既满足农杆菌Vir区基因活化的要求,又适宜于愈伤组织的生长成了转化条件优化的关键之一。研究结果表明,柚木愈伤组织的转化效率随pH值的减小而降低,pH值低于5.6时转化效率显著下降,适宜于EHA105转化愈伤组织的共培养pH值为6.0-6.2,比其它植物种类要求的6.0以下略高。多数林木的再生频率低,严重影响了遗传转化研究,即使有些林木种类的再生频率比较高,但却仅限于幼胚、子叶、上胚轴、下胚轴等幼嫩的外植体。林木育种多是走无性系育种的道路,栽培上使用的良种绝大多数是无性系。用幼胚、子叶、上胚轴、下胚轴等有性材料进行转基因育种,无法保持无性系的所有优良特性。因此,现有转基因技术还无法直接在常规育种的基础上进行转基因育种。对于柚木而言,愈伤组织的再生效率非常低,只有来自茎段的愈伤组织能够以器官再生的形式低频率地再生,因而本研究选择来源于茎段的愈伤进行转基因条件的优化。王关林等认为,由于植物基因转化的频率较低