黄芪对sz诱导胰岛细胞一氧化氮和胰岛素的影响

黄芪对sz诱导胰岛细胞一氧化氮和胰岛素的影响

糖尿病是一种严重威胁人类健康的疾病，其发病与身体的免疫调节紊乱密切相关。当机体对胰岛多种抗原成分失去耐受后,主要组织相容性复合物(MHC)-Ⅱ类分子与其处理的β细胞抗原共同激活辅助性T淋巴细胞中的Th1亚群,抑制Th2亚群,造成Th1型细胞因子分泌增多,Th2型细胞因子分泌减少,导致细胞因子不平衡,进而激活细胞毒性T细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞,从而产生氧自由基、一氧化氮(NO)、细胞因子等,对胰岛β细胞产生直接毒性,最终导致1型糖尿病的发生。自由基在自身免疫性糖尿病的发病过程中以及在胰岛β细胞损伤和影响胰岛素分泌方面都起重要作用,其中NO可能作为胰岛β细胞损伤的中介者,导致胰岛β细胞损伤;清除NO有助于保护胰岛β细胞。黄芪注射液是一种高效的内源性自由基清除剂,有关黄芪注射液对胰岛β细胞损伤保护作用的细胞水平的研究尚未报道。本研究采用链脲佐菌素(STZ)所致的胰岛β细胞损伤模型,观察黄芪注射液对胰岛β细胞的保护作用。1材料表面1.1牛血清因子D-Hanks粉剂系Hyclone公司产品;RPMI1640培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司;牛血清白蛋白(BSA)、胰蛋白酶、STZ、碘化丙锭(PI)、四甲基偶氮唑盐(MTT)购自Sigma公司,萘乙二胺盐酸盐、对氨基苯磺酰胺购自北京化学试剂公司;胰岛素放免分析试剂盒购自中国原子能科学研究所;黄芪注射液:每10mL含生药黄芪20g,成都地奥九泓制药厂,批号Z51021776。1.2细胞胰岛素瘤细胞系RINm5F购自美国典型菌种保藏中心(ATCC)。1.3仪器、检测和检测二氧化碳培养箱(美国Sheil-Lab公司),MicroplateReader550型酶标仪(美国Bio-Rad公司),EPICS-ALTRAII流式细胞仪(美国BeckmanCoulter)。2方法2.1血清学及制度所用细胞培养液RPMI1640含有10%胎牛血清、0.1U/L青霉素、100mg/L链霉素。置37℃、5%的CO2培养箱中培养,5d按1∶3进行传代。2.2保护组和对照组的准备RINm5F细胞培养72h,约80%融合度,按4×108L-1接种于24孔培养板,培养24h待细胞完全贴壁。随机分为6组,每组10孔:对照组、STZ组、10%黄芪组、20%黄芪组、10%黄芪保护组、20%黄芪保护组。STZ组加入终浓度为1.5mmol/L的STZ培养液,共培养24h;10%黄芪组和20%黄芪组分别加入含有10%和20%黄芪注射液的培养液,共培养24h;10%黄芪保护组和20%黄芪保护组分别加入含有10%和20%黄芪注射液的培养液,培养24h,之后更换终浓度为1.5mmol/L的STZ培养液,共培养24h。之后进行下列相关研究。2.3无血清rpmi170培养液制备培养72h后,留取培养上清作NO检测;以冷冻无血清的RPMI1640培养液清洗细胞2遍,加入含终浓度16.7mmol/L葡萄糖、0.2%BSA的无血清RPMI1640培养液,37℃培养2h,取培养上清检测胰岛素。2.4光密度的测定取各组培养液上清100μL加入96孔培养板,加入100μL的1%对氨基苯磺酰胺和0.1%萘乙二胺盐酸盐等量混合液,室温反应15min,取波长540nm测定光密度值。2.5光密度检测按1×108L-1接种于96孔培养板,培养24h,按照各组进行培养。之后弃去培养液,冷冻D-Hanks液清洗细胞,并加入1g/LMTT于37℃孵育3h,弃去MTT加入二甲基亚砜,振摇15min,取490nm测定光密度值。细胞存活率是以对照组细胞存活率为100%,各实验组细胞存活率%=(各实验组OD均值/对照组OD均值)×100%。2.6培养分组培养按5×108L-1接种6孔板,培养24h后待其完全贴壁,按照各组进行培养。之后弃去培养液,用含0.25%胰酶和0.2%EDTA的消化液消化并吹散细胞,用PBS洗涤收集,70%冰预冷乙醇固定,PI避光染色,上流式细胞仪检测细胞凋亡率。2.7统计分析软件数据以x¯±sx¯±s表示,利用SPSS10.0统计软件进行统计分析。符合正态分布,方差齐性分析,多组之间的比较用单因素方差分析,并用LSD进行两两比较,P<0.05为有显著性差异。3结果3.1著性p对照组、10%黄芪组和20%黄芪组细胞胰岛素释放量差异无显著性(P>0.05);STZ明显降低细胞胰岛素释放量(P<0.01),10%和20%黄芪保护组与STZ组相比有显著性差异(P<0.05),与对照组无差异(P>0.05)。见表1。3.2不同树种性差异p、0.05的比较对照组、10%黄芪组和20%黄芪组培养上清NO含量无显著性差异(P>0.05);STZ组NO含量明显高于对照组以及10%和20%黄芪保护组(P<0.01),10%和20%黄芪保护组与对照组无显著性差异(P>0.05)。见表1。3.3p/0.05对照组、10%黄芪组和20%黄芪组细胞凋亡率及细胞存活率无显著性差异(P>0.05);STZ组细胞凋亡率和细胞存活率分别高于和低于对照组(P<0.01),10%和20%黄芪保护组细胞凋亡率和细胞存活率分别低于和高于STZ组(P<0.05),与对照组无显著性差异(P>0.05)。见表1。4对大鼠胰岛细胞作用的影响研究发现,糖尿病早期患者除了免疫、代谢方面的变化外,人体抗自由基防御系统功能也全面下降;同时发现,胰岛组织中丙二醛、NO等浓度明显升高。因此,自由基在1型糖尿病发病过程中起重要作用。STZ是经典的致糖尿病药物。近年来发现STZ可通过诱导细胞凋亡的方式,特异性地损伤胰岛β细胞;同时明确高浓度STZ造成β细胞坏死,低浓度时则导致β细胞凋亡。本研究参考其他文献,选择了1.5mmol/L这个相对低浓度。NO参与许多自由基级联式反应,诱导胰岛β细胞凋亡。本研究证实,STZ作用大鼠胰岛β细胞24h后,NO生成增加,同时破坏大鼠胰岛β细胞功能,高糖刺激胰岛素释放试验时胰岛素分泌量明显降低,因此糖尿病的发病与NO的损伤有密切关系。这一结果提示人们采用抗自由基治疗糖尿病的可能性。动物实验证明黄芪具有抗氧化和自由基的能力,对保持胰岛β细胞的结构完整、维持正常的生理功能有着重要作用,从而保证了β细胞合成、释放胰岛素各环节功能正常,但尚未见细胞水平的研究。本研究着重细胞水平,结果显示不同浓度黄芪注射液作用β细胞后,进行胰岛素刺激实验,与正常β细胞具有相同的胰岛素释放能力,说明黄芪注射液没有影响该细胞的功能。同时黄芪注射液预处理的β细胞,以STZ诱导破坏,NO产生明显降低,并且有效维护β细胞功能。本研究同时检测细胞凋亡率和存活率。结果显示,单纯STZ作用组,β细胞凋亡明显增加,并且细胞存活量较对照组减少;而10%和20%黄芪预处理组,可有效抑制STZ致凋亡作用,同时显著提高胰岛β细胞的存活率。黄芪预处理组STZ作用后,细胞培养液NO水平与对照组差别无显著性,同时有效抑制STZ引起的细胞凋亡作用,进一步说明STZ诱导胰岛β细胞凋亡以及细胞存活率下降与STZ引起NO生成增多有密切关系。本研究从细胞水平证实黄芪具有良好的抗自由基