茶多酚对sz诱导的大鼠糖尿病性白内障防治作用机制研究

茶多酚对sz诱导的大鼠糖尿病性白内障防治作用机制研究

糖尿病是世界上最常见的盲目发生疾病。随着生活水平的提高和人口老化，糖尿病患者的数量每天都在增加。糖尿病性障碍是糖尿病并发症的第二个主要疾病。氧化应激和抗氧化机制削弱造成的氧化损伤是糖尿病性白内障发病的重要机制。还原型谷胱甘肽(reducedglutathionehormone,GSH)和过氧化氢酶(catalase,CAT)均为晶状体内抗氧化的关键物质,它们的数量和活性的改变与晶状体的抗氧化能力的变化密切相关。20世纪80年代以来,国内外开始使用链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)制备糖尿病动物模型,此模型可以成功复制糖尿病并发症,现已用于糖尿病性白内障发病机制和药物防治的研究。茶多酚(teapolyphenols,TP)是绿茶的提取物,因含酚性羟基而极易发生氧化、聚合、缩合等变化,具有较好的抗氧化清除自由基的能力,且安全、无毒、用量少。本研究初步探讨了STZ诱导的大鼠糖尿病性白内障的发病机制及茶多酚抗糖尿病性白内障的效果。1材料和方法1.1材料表面1.1.1动物中心提供纯种雄性Wistar大鼠60只,由山东大学实验动物中心提供,体重150~180g。实验前尾静脉取血,血糖仪检测末梢血糖,排除血糖异常的大鼠。BQ900裂隙灯检查大鼠晶状体及角膜,未见异常。1.1.2u3000酸质盐的制备①1%STZ溶液:取枸橼酸1.082g,枸橼酸三钠1.426g,加去离子水至100mL,采用0.1mol/L的NaOH溶液滴定至pH4.5,用0.22μm微孔过滤器过滤,取STZ(Sigma,St.Louis,MO)1g溶于其中即为1%STZ溶液,实验前新鲜配制;②茶多酚溶液:0.1g/L茶多酚溶液:取100mg茶多酚溶于1000mL蒸馏水中即成,置4℃冷藏。1.1.3结构仪器和仪器生物组织自动脱水机(ZP-12P型),组织包埋机(YB-6LF型),生物组织摊烤片机(YP-6c型),均为湖北孝感亚光医用电子技术有限公司产品;病理切片机:LEICA-2135;普通双目显微镜:OLYMPUS-VANOX;显微镜:OLYMPUS;紫外可见分光光度计:Sp-756型,上海光谱公司产品。美国强生onetouchⅡ型血糖仪;血糖试纸为美国强生公司产品;CAT测定试剂盒、GSH测定试剂盒、谷胱甘肽还原酶(glutathionreductase,GR)测定试剂盒,南京建成生物工程研究所产品。1.2方法1.2.1正常大鼠和tp-dm大鼠糖尿病模型建立从60只大鼠中随机抽取10只为正常组,其余50只随机平均分成两组,一组为STZ诱导糖尿病组(STZ-DM),另一组为茶多酚干预糖尿病组(TP-DM)。STZ-DM组和TP-DM组50只大鼠乙醚轻度麻醉后,通过尾静脉注射1%STZ溶液,剂量为60mg/kg。在STZ注射72h后,当这两组大鼠在正常喂养情况下血糖超过16.7mmol/L,则认为糖尿病模型建立。其中,正常组和STZ-DM组大鼠每笼5只饲养,饮用自来水,自由摄食,饲以大鼠常规颗粒饲料(山东大学实验动物中心提供)。TP-DM组大鼠则每笼1只,每天给予茶多酚溶液100mL饮用,自由摄食大鼠常规颗粒饲料。1.2.2大鼠体重、血糖、血糖、比色、血糖实验过程中,每日观察大鼠饮水、饮食量、尿量的变化,每周称量并记录大鼠体重,每2周大鼠尾端取血,滴于血糖试纸上准确反应5s,使用血糖仪比色并记录,监测末梢血糖变化,血糖低于16.7mmol/L的大鼠剔除实验。1.2.3分布特性分级复方托吡卡胺滴眼液点双眼1次,5s后使大鼠吸入乙醚蒸汽而麻醉,使用BQ900裂隙灯观察晶状体,每周根据晶状体混浊程度分级,分级标准参考牛津大学眼科实验室晶状体分级方法,标准如下:0级为透明晶状体;Ⅰ级为轻度混浊,晶状体周边出现空泡;Ⅱ级为中度混浊,晶状体周边空泡向中心扩展,核出现雾状混浊;Ⅲ级为高度混浊,空泡扩展到核区,核区雾状混浊加重;Ⅳ级为核混浊并发展为成熟白内障。1.2.4大鼠精髓损伤组13周时正常组与STZ-DM组各取2只大鼠断髓处死,立即完整摘取眼球,平衡盐溶液冲洗后置于4%的甲醛溶液中固定,转移至病理室制片,进行脱水包埋,切片,HE染色。1.2.5清除嘴唇及悬韧带13周时断髓法处死所有大鼠,完整摘取眼球,显微镜下由角膜缘切开眼球,娩出晶体,仔细剔除晶状体上附着的虹膜及悬韧带。称量晶状体湿重,以1∶9生理盐水在0℃冰水中研磨,按南京建成生物工程研究所试剂盒说明测定晶状体中GSH含量及GR、CAT活性。1.3spss12软件。0用于统计处理，以比较两组平均值。采用非重叠t检验2结果2.1mmol/l实验前测60只大鼠血糖为4.2~7.1mmol/L,平均值为6.09mmol/L。STZ注射72h后,在正常喂养情况下STZ-DM组和TP-DM组50只大鼠中血糖超过16.7mmol/L者45只,其中STZ-DM组22只,TP-DM组23只,另外5只剔除实验。2.2stz-dm大鼠体重变化STZ-DM组和TP-DM组大鼠自STZ注射后1周出现饮水、饮食、尿量明显增加,约为正常组的3倍。正常组大鼠随着时间的增加体重增长;STZ-DM组和TP-DM组大鼠体重缓慢增长,并逐渐出现糖尿病并发症,出现消瘦和多发感染。第2、9、10、12周时,STZ-DM组各有1只死亡;而TP-DM组则分别在1、2、8、10、12周时各有1只死亡。STZ注射前三组大鼠体重无明显差异(P>0.05),STZ注射后2~12周,STZ-DM组和TP-DM组大鼠体重明显低于正常组,其中,TP-DM组大鼠体重低于STZ-DM组(P<0.05,表1)。另外,TP-DM组大鼠食物摄入较STZ-DM组少。2.3两组大鼠血糖比较STZ注射后72h共有45只(90.0%)大鼠血糖>16.7mmol/L。STZ注射后4、8、12周时,STZ-DM组和TP-DM组大鼠血糖明显高于正常组(P<0.05,表2)。其中,TP-DM组大鼠血糖与同时间点的STZ-DM组无明显差别。STZ注射后第7周,STZ-DM组大鼠中有1只血糖降至16.7mmol/L以下,占总数的2.2%(1/45),予以剔除。STZ-DM组和TP-DM组大鼠糖化血红蛋白含量明显高于正常组(P<0.05,表3),但同时间点TP-DM组和STZ-DM组大鼠糖化血红蛋白无明显差别。2.4各组大鼠中色拉油含量比较STZ注射后第2、4、8、12周检测大鼠发现,STZ-DM组和TP-DM组大鼠甘油三酯含量明显高于正常组(P<0.05,表4)。在第8、12周时,TP-DM组大鼠的甘油三酯含量低于第2、4周,但只在第4周时有统计学意义(P<0.05)。2.5各组大鼠肢体瞳气性状的比较表1正常组大鼠晶状体一直清亮。STZ-DM组和TP-DM组大鼠均于STZ注射后3周开始出现晶状体混浊,6周后混浊程度显著加剧,至10周后出现乳白色混浊。其中,13周时所有糖尿病大鼠晶状体均表现为不同程度的混浊。在STZ注射后6~9周,TP-DM组大鼠晶状体混浊程度低于STZ-DM组大鼠(P<0.05)。而对STZ-DM组和TP-DM组中血糖过高(>20mmol/L)的大鼠进行统计学分析发现,晶状体混浊程度的差别无统计学意义(P>0.05)。对STZ-DM组和TP-DM组中血糖微高(16.7~20.0mmol/L)的大鼠进行统计分析,发现第5至11周TP-DM组大鼠晶状体混浊程度明显低于STZ-DM组(P<0.05)。2.6关于晶体细胞的形态的观察2.6.1细胞培养和变异晶状体上皮细胞位于前囊及赤道部囊下,为单层立方上皮细胞,细胞形态规则,分布均匀,细胞由晶体囊膜包绕,晶状体核心及中心处的纤维细胞未见异常(彩图1)。2.6.2无细胞器区域晶状体纤维细胞前表面覆盖晶状体上皮细胞,赤道部至后囊区域内晶体纤维细胞可见大量未被降解的细胞器,无细胞器区域(organelle-freezone,OFZ)缩小(彩图2)。2.7各组大鼠脏器组织中cat、gsh、tp-dm的活性比较STZ-DM组大鼠晶状体中GSH的含量及CAT的活性均明显低于正常组(P<0.05),并且STZ-DM组大鼠晶状体中CAT的活性及GSH的含量明显低于TP-DM组(P<0.05),而正常组GR的活性与STZ-DM、TP-DM组间的差别无统计学意义(P>0.05,表5)。3讨论3.1tz诱导糖尿病大鼠模型建立STZ具有诱导糖尿病的高度特异性,对实验动物的胰岛β细胞具有高度选择性的毒性作用,因此,本研究使用STZ诱导糖尿病大鼠模型。注射STZ的大鼠90.0%达成模标准,其中2.2%的患糖尿病大鼠在生长过程中血糖恢复正常水平,这可能因为部分大鼠胰岛细胞再生能力旺盛或剩余胰岛细胞代偿能力强。结果显示,前3~6周晶状体混浊进展相对缓慢,第7~12周进展比较迅速,第13周时所有糖尿病大鼠晶状体均出现不同程度的混浊。3.2糖尿病性海被突变大鼠肠道形态变化的机制动物在其成熟过程中,晶状体纤维细胞不断成熟分化,其突出特点是细胞器的突然降解,这被认为是保持晶状体透明性的关键所在。这种降解受到严格的程序化调控。本研究结果显示,在发生糖尿病性白内障的大鼠晶状体内,赤道部至后囊区域内晶状体纤维细胞可见大量未被降解的细胞器,无细胞器区域缩小。这与临床所见的糖尿病性白内障多表现为晶状体后囊下的混浊相一致。可见,异常的细胞器降解与糖尿病性白内障的发生存在密切关系。但是,在高血糖状态下,是哪些调控机制受到破坏或干扰,扰乱了晶状体纤维细胞的细胞器降解过程,或是打破了原来正常的动态平衡,从而导致了白内障的发生,尚有待于进一步研究。3.3氧化代谢roxraft氧化应激是糖尿病性白内障发病的重要机制之一。氧化损伤与晶状体抗氧化防御系统的紊乱在糖尿病性白内障发生和发展中起着重要作用。晶状体的抗氧化主要有两道防御屏障:第一道是GSH,其在白内障形成中的作用有:①保持晶体蛋白-SH处于还原状态,维持细胞膜的完整性,防止血红蛋白氧化,阻止HMW蛋白凝聚,而后者正是光散射和晶状体混浊的基础;②保护膜-SH群,它对离子转运和通透性非常重要;③解毒作用,还原H2O2和其他过氧化物,GSH的氧化还原与H2O2的解毒密切相关。晶状体抗氧化的第二道防御屏障是晶状体抗氧化酶系统,主要是谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase,GSH-px)和CAT、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)。氧化应激还与晶体蛋白质的糖基化通路密切相关。Lee等采用转基因技术探讨糖尿病性白内障多元醇通路与氧化应激的关系,发现多元醇通路的AR使葡萄糖还原为山梨醇,消耗了还原型辅酶Ⅱ,致GSH下降、LPO及丙二醛水平升高;该通路中SD促山梨醇转化成果糖的同时也产生了氧化应激。糖尿病性白内障发病机制中的氧化应激学说和蛋白的非酶糖基化学说可统称为糖的氧化作用,主要是增加晶状体中的自由基。自由基氧化损伤可导致晶状体蛋白质分子构型改变,致其SH-外露,互相连接形成二硫键聚合物,致高分子不溶性蛋白增多。本研究显示,糖尿病大鼠晶状体中重要抗氧化酶GSH含量及CAT活性与正常组相比均明显下降,而这必然会增加晶状体受到氧化剂攻击的机会,致使晶状体蛋白质发生氧化损伤,最终导致白内障的形成。3.4糖尿病大鼠肢体形态变化茶多酚是绿茶的主要生理活性成分,是一种优良的天然抗氧化剂,其抗氧化能力是人工合成抗氧化剂BHT、BHA的4~6倍,是维生素E的6~7倍,是维生素C的5~10倍。本实验在给大鼠饮用茶多酚的同时,对晶状体进行观察,发现茶多酚在糖尿病早期可以降低晶状体