高效液相色谱法测定低聚果糖的研究

高效液相色谱法测定低聚果糖的研究

低聚葡萄糖具有双向调节人体肠道微生态的功能，不仅可以增加肠道中的双叉菌数量，还可以抑制其他有害菌的生长。而且低聚果糖很难被人体消化吸收,是一种低能量的糖,不会引起肥胖。同时,可以认为低聚果糖是一种水溶性膳食纤维,能降低血清胆固醇和甘油三酯含量,摄入后不会引起体内血糖值的大幅度升高。所以低聚果糖可以作为高血压、糖尿病和肥胖症等患者使用的低腐蚀性的防龋齿甜味剂。低聚果糖已成为许多食品的重要有效成分之一,目前检测食品中低聚果糖含量的方法主要有纸色谱分离法,3,5-二硝基水杨酸法,气相色谱法和高效液相色谱法。液相色谱法的色谱条件有很多种,本研究用正交试验详细阐述了高效液相色谱法检测低聚果糖的色谱条件和不同浓度低聚果糖对检出率的影响。1试剂和机器1.1对于第1.4%的过滤膜乙腈(色谱纯);水:超纯水;低聚果糖糖浆(维尔康药业提供):分别配成糖浆浓度为0.3036g/100ml、0.607g/100ml、1.0122g/100ml、2.0265g/100ml、4.0060g/100ml、6.1186g/100ml溶液过0.45μm滤膜备用。葡萄糖、果糖、蔗糖标准溶液:称取葡萄糖、果糖、蔗糖各20mg于25ml容量瓶中,用蒸馏水溶解并定容稀释至刻度,过0.45μm滤膜备用。1.2检测波长rs-pcr美国Waters公司产高效液相色谱议,Waters410差示折光检测器,氨基柱(Waters公司产),WatersTM600Pump,流速1.0ml/min,进样量20.0μl。2实验设计2.1低聚糖糖浆实验方案根据实验室现有的条件,我们考虑检测低聚果糖的主要影响因素为流动相配比、柱温、检测器灵敏度,因此我们用低聚果糖糖浆浓度为1.0122g/100ml的溶液进行实验,本实验采用正交表L9(34)确定实验方案,见表1。2.2高效液相色谱检测根据上述实验中所选定的最佳实验条件,我们对低聚果糖糖浆浓度分别为0.3036g/100ml、0.6073g/100ml、1.0122g/100ml、2.0265g/100ml、4.0060g/100ml、6.1186g/100ml(即低聚果糖含量分别为0.1139g/100ml、0.2277g/100ml、0.3796g/100ml、0.7599g/100ml、1.5022g/100ml、2.2945g/100ml)进行高效液相色谱检测。2.3低聚糖含量的测定由于目前国内尚无低聚果糖标样,因此低聚果糖的含量用面积归一法进行定量,即用高效液相色谱分别测定果糖、葡萄糖、蔗糖的绝对含量,利用下式计算低聚果糖的含量:式中:G、P、Z分别为果糖、葡萄糖、蔗糖的绝对含量,A为低聚果糖的相对含量。3结果与讨论3.1正交试验结果正交实验结果见表2,从表2中我们可以发现流动相配比是影响低聚果糖检出率的最主要的因素,以后依次为柱温和检测器灵敏度。根据正交试验分析规则,三种因素的最优组合应为A2B1C1。即最优检测条件是:流动相乙腈:水(v/v)=75:25,色谱柱温度为30℃,检测器灵敏度为+8。在该色谱条件下,浓度为1.0122g/100ml的低聚果糖糖浆溶液的色谱峰如图1。色谱峰从左到右依次为果糖、葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖。3.1.1色谱峰的重叠当流动相中水的比例减小时,各种糖组分出峰的保留时间有所提前,可以缩短检出时间。但是葡萄糖和果糖的色谱峰不能有效分开,造成色谱峰的重叠,给数据分析带来困难;水的比例增大时,葡萄糖和果糖的色谱峰虽然能很好的分开,但是延长了色谱峰的保留时间。3.1.2色谱峰保留时间在实验中我们发现,随着色谱柱温度的升高,色谱峰保留时间也提前了,但是升高柱温能够造成色谱峰重叠以及峰形的不规则,给数据分析结果带来较大的误差并且使检测结果不够准确。3.1.3立地条件对果的影响从表2正交试验分析结果中可以看出,检测器灵敏度对实验结果的影响并不是特别大。而且在实验中我们发现,随着检测器灵敏度的增大色谱图的基线不容易稳定,还出现了许多杂峰,使我们的目标峰不容易辨认,所以检测器灵敏度我们选择为+8。3.2实验结果的检测在实验中,我们对一系列浓度的低聚果糖溶液进行液相色谱检测,实验结果如表3。从表3中可以看出,低聚果糖的检出率是随糖浓度发生变化的,即随着低聚果糖浓度的增大其检出率也随着增大,检出率与低聚果糖浓度的关系如图2。4色谱条件对低聚果穗检出率的影响由上述实验可得出结论,用HPLC法检测低聚果糖的色谱条件为:流动相乙腈:水(v/v)=75:25,色谱柱温度为30℃,检测器灵敏度为+8。并且,在此条件下低聚果糖的检出率随浓