中华蚊母遗传多样性和遗传结构分析

中华蚊母遗传多样性和遗传结构分析

中国母树（fr.）是属于金缕梅科的一种优良的木兰。它通常被称为水枭科，是一种常绿灌木。根系发达，盘状，有关节和硬度。它可以生活在水中几个月。这是河流固定土壤和护岸的良好树种，也是最好的盆栽树种。中华蚊母除了贵州茂兰有少量分布外,主要分布于长江三峡库区湖北区域(宜昌、巴东、秭归、长阳)和重庆(巫山、黔江、酉阳、丰都、武隆、江津)一带。随着三峡工程的建造,大部分中华蚊母群落将伴随着三峡库区原有消落带的消失其原生境也被淹没,再加上人类的过度采伐,大面积的中华蚊母已经很少见,现存的中华蚊母仅零星分布在库区河谷、溪流两侧。因此对其遗传资源的研究及保护工作十分必要。宜昌三峡植物园自2002年开始对中华蚊母进行抢救性的迁地保护,建立了中华蚊母的迁地保护居群。目前对中华蚊母的研究较少,仅见中华蚊母群落、扦插繁殖及水淹胁迫生理生化特性的研究,对其自然居群和迁地保护居群的遗传结构和遗传多样性研究尚未见报道。本研究采用ISSR分子标记技术,对分布于三峡库区湖北区域的中华蚊母的遗传多样性和居群遗传结构进行分析,比较和评价迁地保护居群和自然居群的遗传多样性水平,为进一步制定迁地保护和群体恢复重建的策略提供科学依据。1材料和方法1.1自然居群采样及生境调查根据遗传多样性研究方法和要求取样,于2008年3~4月赴湖北省内巴东县沿渡河镇、秭归县香溪镇、宜昌市乐天溪镇及长阳县高家堰镇4个自然居群和宜昌市三峡植物园1个迁地保护居群进行采样,同时对各居群生境进行了调查(表1)。为保证取样的可靠性,样本间距在5m以上。每个居群随机采集8~10株幼嫩叶片,共48个样本。样品用硅胶干燥保存,带回实验室置于4℃冰箱保存至1个月内完成电泳实验。1.2方法1.2.1pcr扩增检测采用Doyle等的CTAB法提取DNA,其浓度和纯度用BioPhotometerplus核酸蛋白测定仪检测,260nm/280nm的吸光度(OD)比值在1.8~1.9之间的DNA用于ISSR扩增反应。1.2.2utaq酶活性离子测定ISSR引物是根据加拿大BritishColumbia大学公布的序列设计,由上海生工生物技术有限公司合成。从100对引物中筛选出8对扩增条带较多、亮度清晰的引物,引物序列见表2。扩增反应体系为20μL,包含1×PCRbuffer,模板50ng,1mmol·L-1Mg2+浓度,0.15mmol·L-1dNTPs,0.6μmol·L-1引物,0.5UTaq酶。PCR反应程序为94℃预变性5min;进行35个循环的94℃变性30s,54℃复性45s,72℃延伸90s;72℃延伸7min,4℃保存。PCR产物加入5μLloadingbuffer,分别在含有EB的1.5%琼脂糖凝胶中电泳,在BIO-RAD凝胶电泳成像分析系统上照相。1.2.3遗传多样性分析根据电泳图谱中DNA条带的有无,将ISSR扩增结果转化为二元数据(有带的量化为1,无带的量化为0,仅记录清晰且长度在200~1800bp范围的扩增带),构建二元数据矩阵。应用POPGENEversion1.32软件对全部居群和各单个居群分别进行遗传多样性指数分析:多态位点百分率(PPF)、Shannon信息多样性指数(I)、等位基因数(A)、有效等位基因数(Ae)、Nei’s基因多样性指数(Hp)、种群总遗传变异(Ht)、种群内遗传变异(Hs)、种群遗传距离和遗传相似度、居群间遗传分化系数(Gst)、基因流(Nm)分析。将采用POPGENEversion1.32软件计算得到的Nei等的遗传距离带入NTSYS-pc2.10软件对各个居群间进行UPGMA聚类分析。利用SAS9.0软件对中华蚊母所有48个样品ISSR多态性条带进行主成分三维散点图分析(PCA)。2结果与分析2.1引物扩增多态性采用筛选得到的8个多态性较高的引物对中华蚊母5个居群48个样本进行PCR扩增,共47条带,平均每条引物扩增出5.9条带,片段大小为150~2000bp,其中的多态性条带为44条,平均每条引物扩增的多态性条带为5.5,平均多态性条带百分率为94%(表2)。结果表明该物种具有丰富的遗传变异。图1为引物UBC808对部分参试材料扩增的电泳图谱。2.2推行无砂受精基因多样性指数分析中华蚊母遗传多样性分析结果见表3,中华蚊母物种水平的多态性条带百分率(PPF)为100%,等位基因数(A)为2,有效等位基因数(Ae)为1.3708,Nei’s基因多样性指数(Hp)为0.2379,Shannon信息多样性指数(I)为0.3868,表明中华蚊母物种多样性水平较高。居群多态性条带百分率在68.8%~78.4%之间,等位基因数(A)在1.68~1.79,有效等位基因数(Ae)在1.27~1.375,Nei’s基因多样性指数(Hp)在0.1793~0.2306之间,Shannon信息多样性指数(I)在0.2884~0.3590之间。其中有效等位基因数(Ae)、Nei’s基因多样性指数(Hp)与Shannon信息多样性指数(I)分析结果趋势一致,居群多样性指数大小为:三峡植物园(Ae=1.3705,Hp=0.2306,I=0.3590)>乐天溪(Ae=1.3687,Hp=0.2256,I=0.3505)>高家堰(Ae=1.3602,Hp=0.2150,I=0.3314)>沿渡河(Ae=1.3580,Hp=0.2140,I=0.3268)>香溪(Ae=1.2723,Hp=0.1793,I=0.2884)。结果表明中华蚊母5个居群中的高家堰、乐天溪、沿渡河和宜昌三峡植物园的Shonnon信息指数均大于0.32,其遗传多样性均较高,香溪居群的遗传多样性相对较低。2.3居群间遗传变异的认识利用POPGENEversion1.32分析软件,计算不同居群之间的遗传分化水平。结果表明,5个居群总的遗传变异(Ht)为0.2387,居群内的遗传变异(Hs)为0.2129。根据总的遗传多样性(Ht)和种群内遗传多样性(Hs)估测居群间遗传分化系数(Gst)为0.1080,表明在总的遗传变异中仅有10.80%存在于居群间,89.2%变异存在于居群内,即遗传变异主要存在于居群内。居群间的基因流(Nm)为4.1306,远大于1,表明居群间遗传分化较低,存在较频繁的基因交流,是居群内遗传变异比较高的原因之一。2.4大聚类分析用PopGene1.32软件计算了Nei’s遗传相似度和遗传距离,结果见表4。中华蚊母5个居群两两之间的遗传相似度相对较高,变化范围为0.9322~0.9836,遗传距离的变化范围为0.0165~0.0702。其中居群乐天溪和香溪之间的遗传相似度最大,为0.9836。高家堰居群和三峡植物园之间的遗传相似度最小,为0.9322。遗传距离则正好相反。其中迁地保护居群三峡植物园与沿渡河居群遗传相似度最高(0.9832),其次是与香溪居群(0.9622),而与高家堰居群遗传相似度最低(0.9322),表明沿渡河居群是迁地保护居群三峡植物园的主要母体居群。利用NTSYS-pc2.10软件,采用Nei’s遗传距离对中华蚊母居群进行UPGMA聚类,得树状图(图2)。以0.047为阈值,5个居群分为两大类,高家堰居群单独聚为一类,另一类为乐天溪、香溪、沿渡河和三峡植物园居群。在第二类中乐天溪和香溪居群首先聚为一小类,再与沿渡河和三峡植物园居群聚类,表明乐天溪和香溪居群遗传距离最近、两者亲缘关系较近,乐天溪和香溪居群居群均位于长江边,且地理位置相距较近,也证实了遗传距离分化与地缘距离存在较强的相关性。沿渡河和三峡植物园居群之间的聚类关系也比较近,这表明了三峡植物园居群迁地保护的个体大多来自沿渡河这一居群。2.5聚类分析结果中华蚊母居群主成分分析(PCA)结果表明,前3个主分量所包含的信息量占总信息量的56.35%,其中第一主分量包含的信息量为37.11%,第二主分量包含的信息量为14.04%,第三主分量包含的信息量为5.20%。选取前3个主分量作三维散点图(图3),三维散点图清晰地显示:5个居群的48个个体形成了2个较为独立地分布区,乐天溪、香溪、沿渡河及三峡植物园居群聚合为一个独立分布区,高家堰居群独立为一个分布区,因此主成分分析基本支持上述UPGMA聚类的结果。另外从散点图(图3)可见,每个个体的遗传信息较少相互重叠,从这个层次上也证明样品采集的合理性,同时也说明所采集的48个样本的整体多态性比较高。2.6未固结构多态条带百分率自然居群与迁地保护居群之间的遗传多样性的比较结果表明(表3),高家堰、乐天溪、香溪及沿渡河等自然居群的平均多态条带百分率(PPF)为70.1%,Nei’s基因多样性指数(Hp)为0.2085,Shannon信息多样性指数(I)为0.3243;迁地保护居群三峡植物园的平均多态条带百分率(PPF)为78.4%,Nei’s基因多样性指数(Hp)为0.2306,Shannon信息多样性指数(I)为0.3590。迁地保护居群的遗传多样性水平比自然居群略高,说明三峡植物园对中华蚊母的遗传多样性的迁地保护策略是基本成功的。3讨论3.1物种多样性的比较由于各种植物的演化历史及所处的生态地理环境等多种因素的不同,遗传多样性水平存在差异。一般来说,特有或濒危物种往往遗传变异下降,具有较低的遗传多样性。Hamrick等通过对449种植物的653例等位酶遗传变异研究的总结,综合分析了植物等位酶遗传多样性与系统位置、分布范围、分布地区、生活型、繁育系统、种子传播方式、生殖类型和演替阶段8个特征的相互关系,指出地方特有种或狭域分布的种具有较低的遗传多样性,并在随后的研究中进一步证实了这一推论。但也有报道表明有些特有种甚至濒危种也可能保持较高水平的遗传变异,具有较高的遗传多样性。本研究结果显示,与Nybom统计的基于ISSR位点分析物种的平均Shannon’s多样性指数(I=0.22)相比较,中华蚊母作为三峡库区湖北区域特有的地方性物种具有较高的遗传多样性水平(I=0.3808,Hp=0.2379),遗传多样性水平高于7个地方特有种(Hp=0.2000)和双子叶植物的平均水平(Hp=0.1910),比同科近缘属枫香属植物枫香(I=0.4646,Hp=0.3122)的多样性水平略低。Hamrick等指出,物种的遗传多样性水平及其结构与其生物学特性、生境以及起源进化密不可分,其中繁育系统、分布范围、生活型以及花粉和种子传播方式的影响最大,其中广布、异交和动物传播种子都会使得物种具有较高的遗传多样性。中华蚊母具有较高遗传多样性可能由以下几方面的原因所致。首先,中华蚊母属金缕梅科蚊母树属植物,曾分布在北美和东亚,由于新第三纪以后气候变化以及第四纪冰期的作用,气候剧变及严寒恶劣的环境对金缕梅科这样一个亚热带和热带类群极为不利,很多类群在中纬度和高纬度地区逐渐灭绝,其分布区明显向南收缩,只有在一些局部地区形成该类群的“避难所”。曾分布于北美地区的该物种已全部灭绝,现存中华蚊母仅分布于东亚,而中国主要分布于三峡库区一带。三峡库区属于欧亚古大陆的南缘,由于喜马拉雅山运动,该地区河谷不断下切和高原不断上升,群山起伏、河谷交错,气候类型丰富多样,是分布于该地区的物种遗传变异丰富的原因之一。其次,中华蚊母为多年生灌木,其种子成熟后自然开裂落地,随波逐流,遇阻于石缝,水退,便落地生根,故多生长在乱石夹缝中。野外实验发现中华蚊母属于异花授粉的虫媒传粉植物,本研究的分子标记结果也表明该物种具有较高的基因杂合度(Hp=0.2379),推测其交配系统为异交,而且基因交流比较频繁(Nm=4.1306)。中华蚊母这些特殊的生物学特性、历史进化起源和对生境的适应可能是其具有较高遗传多样性的重要原因。3.2基因流变异居群的检测与保护本研究对三峡植物园迁地保护居群和自然居群的ISSR遗传多样性评价结果表明,迁地居群保持了其自然居群状态的遗传多样性水平。在中华蚊母种内居群水平上,遗传多样性较高,其中以宜昌乐天溪居群的遗传多样性(PPF=78.4%;Hp=0.2256;I=0.3505)最高,可能与当地滩多,生境复杂有关。迁地保护居群三峡植物园的遗传多样性水平比自然居群略高,这说明迁地保护是基本成功的。迁地保护居群和沿渡河居群聚为一类,两者遗传相似系数大,表明迁地保护居群虽有附近居群个体的渗入,个体主要来自沿渡河居群,在实际采样时确是在巴东沿渡河居群取样较多。同时,弄清楚物种的遗传结构也有利于制定出切实可行的保护策略。一般来讲,居群的遗传分化程度越高,纳入取样范围的居群数应越多。根据95%的保护标准,利用Lowe等的计算方法可以估计迁地保护需要取样的居群数目。例如在实际取样时,对于一个基因流比较小,Gst值为0.60的物种,至少要取6个居群才能保存其95%的遗传多样性,而对于Gst值为0.20的物种而言,要达到同样的效果则只需取样2个居群就足够。本研究结果发现中华蚊母Gst为0.1080,Nm为4.1306,表明只要对1个居群取样就可保存物种95%的遗传变异。因此结合前面的分析,进一步说明了对中华蚊母的迁地保护取样策略基本合理。但由于本研究取样点较少,取样数不多,有可能导致中华蚊母遗传多样性较高,同时在5个居群的聚类分析发现,高家堰居群单独聚为一类,可能因为高家堰较其他居群离长江边较远,坡地灌丛和小溪河谷较多,从而形成其较其他居群所具有的独特遗传变异,因此,在进一步的取样中应加大对高家堰居群的取样,有助于保护中华蚊母更加丰富的遗传多样性,