病原菌分离培养与鉴定

MedicalMicrobiology

andParasitology

Chapter6MethodsforIdentificationandPrincipleofPreventionandcureofBacterialInfection.DeptertmentofmedicalMicrobiologyandParasitologyKEYTERMS一、细菌学诊断标本的采集与送检病原菌的分离培养与鉴定病原菌抗原的检测二、血清学诊断三、分子生物学诊断2CONTENTSIntrinsicresistanceAcquiredresistanceBiochemicalmechanismsofbacterialdrug-resistance生化模式转变为数学模式自动微生物鉴定和药敏分析系统16SrRNA序列分析生物芯片技术细

菌

感

染

的

检测细菌感染的检查方法一、细菌学诊断标本的采集与送检病原菌的分离培养与鉴定病原菌抗原的检测二、血清学诊断

有凝集试验、ELISA、沉淀试验、中和试验等。三、分子生物学诊断标本的采集和送检六原则避免杂菌污染不同期不同标本用抗生素以前采集病变明显部位运送注意保存标本必须新鲜（一）标本采集与送检

collectionandtransportationofspecimen细菌感染的检查方法（二）病原菌分离培养与鉴定：形态学检查直接涂片镜检标本：脓性分泌物、米泔水样粪便、痰液、分离培养物分离培养物涂片镜检不染色检查法压滴法悬滴法暗视野显微镜法检查用仪器普通光学显微镜lightmicroscope暗视野显微镜dark-fieldmicroscope荧光显微镜fluorescencemicroscope……染色检查法革兰染色法Gram’sstain抗酸染色acid-faststain特殊染色specialstain荧光染色fluorescencestain7（2）形态学检查:染色法革兰染色抗酸染色荧光金胺染色特异性荧光抗体其他特殊染色StaphylococcusaureusEscherichiacoliG-

Neisseriameningitidis（二）病原菌的分离培养与鉴定

inoculationandidentification

forisolation临床标本分离培养接种挑取单菌落鉴定(成分检测）clinicalspecimeninoculationforisolationpickupsinglecolonyidentification纯培养pureculture分离培养最重要的是得到单菌落！三划线法分离单菌落threestreaksagarplate细菌的菌落Bacterialcolonies菌落的大小、形态、颜色、表面性状、透明度和溶血性等对细菌做出初步的识别细菌学诊断的一般程序标本脓/痰/尿血、脑脊液等涂片、染色、镜检分离培养纯培养生化反应血清学鉴定药敏试验动物实验增菌细菌分离培养与鉴定11细菌纯培养物的鉴定兼性厌氧菌专性厌氧菌需氧菌药物敏感试验鉴定形态和染色菌落特征生化试验生物芯片检测毒力试验病原菌抗原生化试验肠道感染细菌在含铁双糖培养基上的生化反应13细菌的生化反应糖发酵试验H2S试验枸橼酸盐利用实验抗生素敏感性试验Antimicrobialsusceptibilitytest最低抑菌浓度（minimuminhibitoryconcentration，MIC）最低杀菌浓度（minimumbactericidalcencentration，MBC）抗生素连续梯度法（E-test法）将稀释法和扩散法的原理相结合，使用预先设定的稳定且连续的抗菌药物浓度梯度，采用琼脂培养基培养以确定不同抗菌药物对微生物的最低抑菌浓度（MIC）。16

将培养基上分离的可疑致病菌配制成纯菌液，放入自动微生物鉴定及药敏分析系统中，通过计算机自动扫描、读数、分析、最后报告鉴定及药敏结果。摘自《临床微生物检验》（第五版）人民卫生出版社17自动微生物鉴定及药敏分析系统自动微生物鉴定及药敏分析系统药敏检测原理微型化的肉汤稀释试验根据CLSI标准得到相应敏感度：敏感、中度敏感和耐药微生物数码鉴定原理计算并比较数据库内每个细菌条目对系统中每个生化反应出现的频率总和性能特点自动化程度较高、检测速度快、可鉴定细菌种类及药敏试验种类多、数据处理软件功能强大、结果准确可靠系统组成测试卡（板）、菌液接种器、培养和监测系统、数据管理系统自动微生物鉴定及药敏分析系统18细菌纯培养物的鉴定兼性厌氧菌专性厌氧菌需氧菌药物敏感试验鉴定形态和染色菌落特征生化试验生物芯片检测毒力试验病原菌抗原动物试验：细菌毒力的测定*LD50

*ID50小鼠豚鼠家兔细菌纯培养物的鉴定兼性厌氧菌专性厌氧菌需氧菌药物敏感试验鉴定形态和染色菌落特征生化试验生物芯片检测毒力试验病原菌抗原（三）病原菌抗原的检测原理：

细菌或其抗原成分（未知）＋特异性抗体（已知）

肉眼可见结果或可检测的信号适用于：细菌培养不易成功，患者使用了抗生素常用方法：

凝集试验（玻片、协同和乳胶等）

免疫标记技术（酶、荧光素、同位素）病原菌（抗原）核酸的检测(见分子生物学诊断）细菌感染的检查方法细菌纯培养物的鉴定兼性厌氧菌专性厌氧菌需氧菌药物敏感试验鉴定形态和染色菌落特征生化试验生物芯片检测毒力试验病原菌抗原（四）生物芯片技术将核酸片段、蛋白质或酶、抗原或抗体、细胞及组织等生物样品有序地固定于硅片、尼龙膜等固相支持物上在一定的条件下进行生化反应。用化学荧光法、酶标法或同位素法显示反应结果，通过特定的仪器读取与收集数据，并用软件进行数据分析，从而判断样品中靶分子的种类和数量。24二、血清学诊断

Serological

identification抗体效价+病人血清（未知抗体）病毒或其抗原（已知）－常用于病程长和抗原性较强的病原体引起的感染－双份血清IgG抗体效价4倍升高，具有诊断价值IgM：出现早，消失快，可用于早期诊断，

但试剂盒质量往往不过关，易出现假阳性。IgG：出现晚，持续时间长，不能用于早期诊断。细菌性感染的血清学诊断

血清学试验

疾病举例直接凝集反应

肥达试验、外斐试验乳胶凝集试验

脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌沉淀试验

梅毒间接免疫荧光技术

各类微生物感染补体结合试验Q热中和试验

风湿热（抗O试验）酶联免疫吸附试验

各类微生物感染26三、分子生物学诊断核酸杂交hybridization dotblothybridization Southernblothybridization Northernblothybridization insituhybridization聚合酶链反应PCR、核酸序列分析sequencing16SrRNA基因序列分析基因芯片（genechip）技术核酸杂交hybridization例：细菌外毒素的检测动物试验：将待检标本接种于动物

体内，观察是否出现由外毒素引起的症状。免疫学方法：常用的有乳胶凝集试验、酶联免疫吸附试验等。

分子杂交技术：用同位素标记的探针与待检标本进行DNA-DNA分子杂交，以测定待检标本中与探针同源的核苷酸序列。细菌感染的检查方法白喉毒力试验（Klektest）细菌感染的特异性预防

细菌感染的特异性预防是应用获得性免疫的原理，给机体注射或服用疫苗、类毒素等免疫原性物质或注射某种特异性抗体、细胞免疫制剂等，以达到特异性预治病原菌感染的能力，这种方法亦称人工免疫。用于人工免疫的疫苗、类毒素、免疫血清、细胞制剂以及诊断制剂（结核菌素、诊断血清、诊断菌液等）等统称为生物制品。种类：人工主动免疫、人工被动免疫人工主动免疫常用制剂如下：减毒活疫苗：BCG、炭疽活疫苗、鼠疫活疫苗等灭活疫苗：伤寒死疫苗、百日咳死疫苗、流脑死疫苗等类毒素：破伤风类毒素、白喉类毒素等亚单位疫苗：脑膜炎及肺炎球菌荚膜多糖疫苗基因工程疫苗：大肠杆菌肠毒素基因重组疫苗基因疫苗：正在深入研究之中。免疫接种可以预防的细菌感染性疾病疫苗名称可预防疾病卡介苗（BCG）结核病白百破三联疫苗（DPT）白喉、百日咳、破伤风流脑疫苗（MeningococcusAvaccine）流行性脑脊髓膜炎白破二联疫苗（DT）白喉、破伤风成人型白喉类毒素白喉B型流感嗜血杆菌疫苗（HIBvaccine）小儿脑膜炎、肺炎肺炎球菌肺炎疫苗（Pneumococcalvaccine）肺炎球菌肺炎二、人工被动免疫

（Artificialpassiveimmunization）人工被动免疫是将含有特异性抗体的免疫血清或纯化免疫球蛋白或制备的免疫细胞、细胞因子等输入人体使机体立即获得免疫力的过程叫人工被动免疫，主要用于治疗或紧急预防。突出的特点是立即获得免疫力，但维持时间较短，可用于某些急性传染病的紧急预防和治疗。常用制剂如下：抗毒素:破伤风抗毒素、白喉抗毒素等。抗菌血清：目前已基本淘汰。只是多重耐药菌（如铜绿假单胞菌）感染时，可考虑抗菌血清治疗。免疫球蛋白：胎盘球蛋白和丙种球蛋白细胞免疫制剂：转移因子，将特异性的细胞免疫

应答能力转移给未经致敏的淋巴细胞。人工主动与被动免疫比较区别点人工主动免疫人工被动免疫免疫物质接种次数免疫力出现时间免疫力维持时间用途抗原1~3次慢（2~4周）长（数月~数年）多用于预防抗体或细胞因子1次快（立即出现）短（2~3周）用于治疗或应急预防第三节细菌感染治疗－化学疗法chemotherapy1929–Penicillindiscovered1930s–Sulfadrugsdiscovered1969–USsurgeonGen,claimsendinfectiousdiseasesToday–Bacteriawithmulti-drug resistanceFlemingDomagk一、抗菌药物的杀菌机制抑制细菌细胞壁的合成：青霉素、溶菌酶等影响细菌胞浆膜通透性：多粘菌素等抗生素抑制细菌蛋白质的合成：红霉素、链霉素等抑制细菌的核酸代谢：利福平等抗生素抑制细菌的叶酸代谢：磺胺类等抗生素CellwallsynthesisDNAreplication-内酰胺类万古霉素环丝氨酸杆菌肽Cellmembrane多粘菌素Proteinsynthesis（30Sribosome）氨基糖苷类四环素Proteinsynthesis（50Sribosome）大环内脂类林可霉素喹诺酮类

利福平RNAsynthesisAntimetabolites磺胺SelectiveInhibition/Toxicity>过量用药>不适当地用药>在家畜和家禽生产中大量使用抗生素现状–

细菌的多重抗药性细菌耐药性的分类及产生机制细菌耐药性的分类细菌耐药性的类型

固有耐药性获得耐药性

染色体突变（自发随机突变）可传递的耐药性

R质粒转移转座子介导整合子介导（一）获得性耐药的遗传机制（1）染色体突变自然发生，突变率10-12~10-7与抗菌药物无必然关系相对稳定可回复突变

（2）质粒介导的耐药：多重常见、可丢失、可转移（3）转座子介导的耐药（4）整合子与多重耐药1.耐药性细菌的耐药基因来源接合2、耐药基因在细菌间的转移方式转化转导转座（二）细菌耐药的生化机制灭活酶或钝化酶的产生药物作用的靶位发生改变抗菌药物的渗透障碍主动外排机制形成生物被膜

细菌耐药性的生化机制示意图药物活化药物靶位药物进入药物钝化药物去毒发挥作用药物外排药物进入障碍药物效应药物靶位结构功能改变细菌的分泌系统药物外排药物代谢失活药物活化5、形成生物被膜铜绿假单胞菌的生物被膜电子显微镜放大5000倍细菌耐药的防治1.合理使用抗菌药物：2.严格执行消毒隔离制度：3.加强药政管理：4.研制新的抗菌药物5.破坏耐药基因抗菌药物治疗性应用的基本原则诊断为细菌性感染者，方有指征应用抗菌药物；尽早查明感染病原，根据病原种类及细菌药物敏感试验结果选用抗菌药物；按照药物抗菌作用特点及其体内过程特点选择用药；抗菌药物治疗方案应综合患者病情、病原菌种类及抗菌药物特点制订。警惕、避免耐药形成49思考题:病原菌标本采集与送检的原则是什么?检验程序有哪些?什么叫血清学检查?常用血清学检查种类有哪些?主要作为哪些疾病的辅助诊断?取脑脊液进行细菌感染的检查，用什么免疫学方法可以进行快速诊断？检查病原菌抗原和血清中特异性抗体选用的免疫学方法相同吗？自动微生物鉴定和药敏分析系统的原理和特点是什么？检测细菌核酸，可选择的实验方法有哪些？其原理与特点是什么？紧急预防细菌感染时应采用的方法是什么？为什么？临床病例：患者，钟x