植物组培技术存在的问题及解决方法

植物组培技术存在的问题及解决方法摘要针对当前植物组织培养中存在的外植体污染、褐化和玻璃化现象进行了阐述，同时对相应的解决方法的研究现状进行了综述，并展望了植物组织培养的研究前景。关键词植物；组织培养；外植体；问题；解决方法植物组织培养是根据植物细胞具有全能性的理论，以植物细胞培养技术为前提的一项生物技术。利用植物体离体的器官，诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株。利用组培技术可以快速繁殖大量种苗，有利于品种更新，还可用于脱除病毒和无病毒种苗的繁殖[1]。1植物组织培养中存在的问题1.1外植体污染真菌污染和细菌污染是外植体污染的2种主要形式。其中，细菌污染是由各种细菌及内生菌引发的，潜伏期很长，有时继代几次后才表现出来。真菌污染易于发现，由霉菌和酵母菌引发，污染速度快，控制困难，一旦发生则损失较大[2]。污染既有可能是外植体带入，也有可能是在培养过程中造成的。培养室灭菌不彻底，操作污染，培养基高压灭菌不到位，后期培养过程中经常出入等原因都有可能造成污染发生[3]。1.2外植体褐变外植体褐变是指培养过程中，由于外植体释放褐色物质导致培养基逐渐变褐，最终使外植体变成褐色而死亡。就外植体本身而言，不同的品种选择的部位、大小、形状、选择的时期、预处理方式、培养条件（包括培养基的成分、状态）、培养的外部环境（如光照、温度、pH值）等都是引发褐变的原因[4]。1.3外植体玻璃化玻璃化是指培养过程中，组培苗的叶、嫩梢呈水渍状（透明或半透明），芽苗矮小肿胀失绿，叶片皱缩成纵向卷伸，脆弱易碎[5]。与褐变一样，玻璃化既有外植体本身的原因也有外部原因，是培养环境中一些物理、化学因素和生化因子共同作用使植物组织新陈代谢紊乱所致[6]。外植体的选择、温度、光照、封口的材料、培养基的类型等都会造成玻璃化，液体培养是导致玻璃化的主要原因[7]。2组培问题解决途径2.1污染问题的解决（1）组培室消毒。该法常用的有紫外灯照射、空气净化器、甲醛熏蒸等。邹瑜等利用苍术、艾叶熏蒸，这种方法价格低廉，简单易行，熏蒸消毒效果好且持续时间长[8-9]。（2）外植体消毒。袁源在青天葵组培中认为使用5%次氯酸钠清洗10min，可基本抑制污染，植物材料仍能正常生长，升汞灭菌虽可较彻底抑制污染，但对植物伤害较大，只用于对感染的球茎灭菌[10]。（3）对于真菌污染的控制。培养基加入75%百菌清可湿性粉剂可以有效地控制青霉菌的污染。为了消除植物组织培养过程中出现的真菌和细菌污染，而又不杀伤植物组织，采用多菌灵和青霉素混合溶液浸泡污染的组培苗茎段的结果发现，多菌灵对真菌有杀灭作用，对细菌没有明显作用，青霉素只对细菌有抑制作用，对污染的组培苗采用75%乙醇和0.1%HgCl2处理可彻底杀灭真菌和细菌[11]。75%代森锰锌可湿性粉剂对枸杞组织培养过程中出现的真菌污染具有显著的防治效果，污染率仅仅10%，且枸杞培养物的生长情况良好[12]。（4）对细菌污染的控制。使用抗生素和杀菌剂（如多菌灵、甲基托布津、丙酸钠和甲霜灵等）可有效控制细菌污染，有研究表明同时使用2种或2种以上的抗生素，效果优于单独使用1种抗生素，如Reed采用1215mg/L庆大霉素+1000mg/L链霉素效果很好。但是上述方法只是暂时的解决方案，其缺点是只能抑制细菌生长而无法将其完全杀死，且长期使用会对组培苗产生不良影响。因此，还需进一步筛选更合适的方法来消除已产生的污染[13]。2.2褐变问题的解决在木本植物中，单宁含量或色素含量高的植物容易发生褐变[14]。同一种植物中，幼嫩的外植体比成龄材料褐变轻[15]。褐变的发生与外植体组织中酚类化合物的数量及多酚氧化酶活性有直接关系。外植体在进行培养前的处理过程中，组织中的酚类物质部分渗入培养基中[16]，随着组织的老化病变会使多酚氧化酶激活而引起褐变[17]，所以尽量选择幼嫩的组织。外植体越小，切面与体积的比率越大，伤害及褐化程度越大[18]。冬季的芽不易生长，外植体宜选用早春和秋季的材料[19]。在选择培养基时，4种培养基的无机盐以改良MS（大量元素减半）和1/2MS的效果最好，MS的效果较差。较低浓度的无机盐含量有利于防止植物材料褐化[20]。另外，其pH值也与褐变程度有较大关系[17，21]。赵伶俐等认为在蝴蝶兰组培中培养基的pH值为6.5时最好[22]。在水稻细胞的培养基中，添加植酸（PA，有抗氧化作用）可使生色物质的含量下降或PA与PPO分子中的Cu2+结合，从而使其活力降低，可防止褐变[23]。VC为多羟基还原物质，在酶的催化下能消耗溶解氧，使酚类物质因缺氧而无法氧化，VC也会影响多酚氧化酶的活性，从而阻止酚类物质氧化[24]。在培养基中加入活性炭500.0mg/L，有利于减轻褐变[25]。在进行培养时，不利的环境条件都能造成细胞的程序化死亡，光照过强[26]或温度过高[16，27]，会提高PPO的活性，促进多酚类物质的氧化，从而加速被培养组织的褐变。因此，初期培养要在黑暗或弱光下进行[21]。2.3玻璃化问题的解决增加自然光照。试验发现，玻璃苗放于自然光下几天后茎、叶变红，玻璃化逐渐消失，因自然光中的紫外线能促进试管苗成熟，加快木质化[28]。通过加大昼夜温差可以降低玻璃化的程度[29]。尽可能采用大一点的容器培养，并且尽可能地减小接种密度[30]。马济民认为和蒸馏水相比自来水更能克服桉树组织培养过程中的玻璃化现象[31]。降低培养容器内部环境的相对湿度[32]。有学者认为玻璃苗是培养瓶内气体与外界交换不畅造成的。密闭的封瓶口材料是导致玻璃化的原因之一。用塑料膜和透气性薄膜都能很好地避免玻璃苗的发生，但采用塑料瓶加上透气膜时会更好一些[33]。Deberg的研究表明，随琼脂浓度的增加，KT利用率降低。同时也证明，随BA浓度的增加，玻璃化率增加[34]。培养基中高的含氮量，特别是高的氨态氮，也是导致玻璃化的因素[7，34-35]。试验表明，适当增加组培瓶封口膜的透气性，琼脂浓度选择6.0g/L及碳源选择蔗糖，均可以有效地防止草莓玻璃化苗的发生[32]。张丽珍等[36]研究发现在MS基本培养基中添加4%蔗糖、0.75%琼脂、1.0mg/L6-BA和0.08%碳粉能有效控制青蒿组织培苗的玻璃化现象，使增殖系数较高，玻璃化率相对较低，组培苗也较健壮，移栽成活率高。适当降低培养基中细胞分裂素和赤霉素的浓度也有利于减轻玻璃化的现象。许多研究发现表明继代培养中所累积的高浓度的细胞分裂素是导致试管苗玻璃化的主要因素[37]。利用固体培养，增加琼脂浓度，降低培养基的衬质势，造成细胞吸水阻遏。提高琼脂纯度，也可降低玻璃化[34]。并且琼脂浓度为0.6%时，玻璃化程度最低[38-39]。3展望随着植物组培技术的备受关注，其研究领域也在不断扩大。现已逐渐扩展到分子生物学、细胞生物学、遗传学、组织学、胚胎学、园艺学、育种学等方面。特别是近30年，植物组培技术在理论上和实际运用上已经越来越成熟。从植物的快速繁殖，花药的离体培养到细胞器培养，原生质融合以及DNA重组技术都证明了组培技术的逐步成熟和完善，如何解决组织培养过程中存在的问题显得尤为重要。4参考文献[1]赵蓬晖，张江涛，马红卫.植物组织培养中的几个常见问题与对策[J].河南林业科技，2001，21（2）：27-28.[2]周俊辉，周厚高，刘花全.植物组织培养中的内生菌污染问题[J].广西植物，2003，23（1）：41-47.[3]柴向华，李军，张秀珊，等.植物组织培养中污染的控制[J].热带农业科学，2003（6）：40-44.[4]朱文祥，王金荣，李珺，等.植物组织培养中外植体褐变研究进展[J].安徽农业科学，2010（31）：17399-17401.[5]刘淑玉，祁东文，冯文伟.如何克服组织培养中试管苗玻璃化问题[J].新疆林业，2001（1）：15.[6]卜学贤，陈维伦.试管植物的玻璃化现象[J].植物生理学通讯，1987（5）：13-18.[7]牟彤，吴瑕，胡鑫宇.不同激素条件对草莓组培苗快繁的影响[J].安徽农学通报，2010，16（5）：78-79.[8]邹英宁，吴强盛.果树组织培养中褐变现象及其抑制研究进展[J].长江大学学报，2007（9）：47-50.[9]邹瑜，林贵美，韦华芳，等.四种方法对组培室空气消毒效果的研究[J].北方园艺，2009（8）：117-119.[10]袁源，何瑞，詹若挺.青天葵组培扩繁中的污染控制初探[J].现代中药研究与实践，2010（2）：25-27.[11]李颖，李春燕.多菌灵和青霉素在组培污染中的应用[J].林业科技，2002（1）：6-8.[12]李晓莺，罗青，张曦燕，等.杀菌剂对枸杞组织培养中真菌污染的控制作用[J].安徽农业科学，2008（36）：15804-15841.[13]周俊辉，李宏彬，杨耀强，等.植物组织培养中污染的鉴定与防止初步研究[J].微生物学杂志，2002，22（2）：53-55.[14]高国训.植物组织培养中的褐变问题[J].植物生理学通讯，1999，35（6）：501-506.[15]马莉贞.植物组织培养中褐变现象的研究[J].安徽农业科学，2006，34（15）：3583-3584.[16]杨玲，葛红，黄绵佳，等.热激处理对蝴蝶兰组培褐变的影响[J].园艺学报，2008（1）：143-146.[17]许传俊，李玲.几种培养基及光照对蝴蝶兰叶片外植体褐变的影响[J].亚热带植物科学，2006（3）：9-12.[18]郭兆武，郭旭春，高建芳，等.黄花石蒜不同大小外植体对其组织培养效果的影响[J].中药材，2010（7）：1038-1041.[19]孟娉，吕国华，潘新仿.不同熏蒸方法对接种室空气粉尘浓度的影响[J].甘肃农业，2005（3）：89.[20]赵鹂，杨晖.大花蕙兰外植体组培褐变的控制[J].中国农学通报，2008，24（5）：109-112.[21]晁慧娟，刘敏，姬谦龙，等.红颜草莓茎尖培养与快速繁殖[J].北京农学院学报，2009，10（4）：14-16.[22]赵伶俐，葛红，范崇辉，等.蝴蝶兰组培pH和温度对外植体褐化的影响[J].园艺学报，2006（6）：1373-1376.[23]姜爱丽，钟璐，胡文忠，等.3种褐变抑制剂对减轻鲜切苹果褐变效果的影响[J].食品与发酵工业，2010（7）：45-48.[24]陈惠娟.植物组织培养中褐变的产生机理及克服措施[J].植物保护，2005，31（2）：79-82.[25]张红.库拉索芦荟组培中的褐变现象及防止[J].安徽农业科学，2008，36（6）：2257-2258.[26]刘万敏.光照强度与桃汁褐变的相关性探讨[J].气象，1994（11）：55-57.[27]赵滢，杨树华，葛红.蝴蝶兰组织培养中褐变发生及控制的研究进展[J].北方园艺，2009（11）：110-114.[28]蔡祖国，徐小彪，周会萍.植物组织培养中的玻璃化现象及其预防[J].生物技术通讯，2005（6）：353-355.[29]孙满芝，尹成涛.植物组培过程中玻璃化程度的发生与解决措施[J].山东林业科技，2001（6）：19-20.[30]杨雪，吴国盛，范加勤.红叶石楠组培苗玻璃化影响因子及其克服技术研究[J].江西农业大学学报，2009，31（5）：906-910.[31]马济民.桉树组织培养中的“玻璃化”现象及其克服措施[J].安徽农业科学，2009，37（27）：29-30.[32]任东植，李峰，曲运琴，等.影响枣组培苗玻璃化的几个因素及其防治[J].植物生理学通讯，2000（2）：21-23.[33]丁国昌，马钟丽，林思祖.厚荚相思玻璃化苗细胞超微结构的变化[J].福建林学院学报，2007，27（1）：40-43.[34]张敏，张曙光，孙红绪，等.对影响草莓组培苗玻璃化若干因素的探讨[J].湖北农业科学，2002（11）：82-83.[35]孙满芝，尹成涛.植物组培过程中玻璃化现象的发生与解决措施[J].山东林业科技，2001（6）：19-20.[36]张丽珍，杨东业，靳振江，等.青蒿组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