denv非结构蛋白1在我国登革病毒致病和保护性免疫中的作用

denv非结构蛋白1在我国登革病毒致病和保护性免疫中的作用

1denv在免疫重建中的应用感染登格病毒（denv）有四种类型，分别是denv-1、denv-2、denv-3和denv-4。任何一型DENV感染均可表现为无症状或引起轻微的自限性疾病登革热(Denguefever,DF)以及以自发性出血为特征的严重疾病登革出血热(Denguehemorrhagicfever,DHF)或更为严重的以循环衰竭为特征的登革休克综合症(Dengueshocksyndrome,DSS)。由DENV所致的登革热是主要关切的国际公共卫生问题,在我国南方地区,特别是东南沿海各省几乎每年均发生登革热流行,流行范围有从南向北逐步扩展的趋势。人类对DENV的防治面临着许多难题,没有特异性的治疗药物,没有安全有效的疫苗。四个血清型的登革病毒之间缺乏交叉免疫保护作用,初次感染某一型DENV可能没有典型的症状,并会对该型病毒的再次感染产生长久的免疫力,二次感染异型登革病毒时初次感染登革病毒所产生的抗包膜(E)蛋白和前膜(proM)蛋白等结构蛋白抗体加速DHF/DSS发生。单纯的登革病毒结构蛋白嵌合疫苗不能诱导针对四种血清型DENV的均衡、持久的保护性免疫,也是当前研制特异性登革疫苗的主要障碍之一,可能需要非结构蛋白成分。登革病毒非结构蛋白1(DENVNS1)是病毒编码的一种重要的非结构糖蛋白,不参与病毒构成的,同时为病毒复制和扩增所必需,具有很强的免疫原性,在病毒的致病机制和保护性免疫中具有重要的作用,成为构建DENV亚单位疫苗的候选靶标。本文就该蛋白结构和功能研究进展进行综述。2ns1蛋白及亚结构域DENVNS1基因编码区为1056个碱基,位于包膜蛋白基因和非结构蛋白2A基因之间,共编码352个氨基酸残基。NS1单体具有高度的亲水性,含12半胱氨酸残基,形成6不连续的二硫键,NS1蛋白二硫键分别以下顺序构成:C1/C2、C3/C4、C5/C6、C7/C12、C8/C9和C10/C11,这些二硫键帮助单体正确折叠和维护单体结构的稳定。DENVNS1相对分子量约43kD,该蛋白主要有两形式,二聚体的形式NS1主要存在感染病毒细胞浆的包囊内,同病毒dsRNA和其他同种病毒基因复制相关非结构蛋白聚集在囊包内病毒复制位点,少量存在以感染病毒细胞的细胞膜表面,称之为膜性NS1(mNS1);该蛋白也以六聚体脂蛋白颗粒的形式分泌到哺乳动物细胞培养液中或感染患者血浆中,称为分泌型NS1(sNS1)。NS1蛋白由3个区域构成,第一个结构域由蛋白第1-29氨基酸残基构成,含两个β转角构成的小的功能区切换结构,二硫键(C1/C2)保持β转角结构稳定。β转角沿二聚体轴心扩展,缠绕形成一个4股β折叠,该折叠为一个弯曲的卷筒样结构,该区域称为卷筒样结构功能域。第二个结构域位于NS1蛋白第30~180位氨基酸残基,该区域从中心的β片层突出像一个翼瓣。每个翼瓣结构域包含两个糖基化位点(Asn130和Asn175),一个内在的二硫键(C3/C4)和2个亚结构域。一亚结构域位于NS1蛋白第38~151位氨基酸残基,由一个4股的β折叠、2个α螺旋和一个顶端的无序结构构成。另一个亚结构域为不连续的亚结构域(第30~37位和第152~180位氨基酸残基构成)包裹β卷筒样结构,该亚域也通过二硫键(C5/C6)连接翼瓣区域和中心β折叠区域。第三个结构域位于NS1蛋白第181~352位氨基酸残基,包含NS1羟基端半个NS1蛋白,包含一个由18个沿着二聚体长轴延展的连续的β折叠,像一阶梯中的横档。这个核心β“阶梯”结构域由NS1蛋白一半的C末端构成(第181~352位氨基酸残基),在二聚体中排列每个单体贡献9个的横档构成反向平行β阶梯。每个单体前5个β折叠股开始在二聚体界面,依次朝着梯子末端前行。除了位于β13和β14见一个长意大利面条式环外(第219~271位氨基酸残基),大多数内部环较短,这个区域(第219~271位氨基酸残基)缺乏二级结构而是通过57个氢键有序维持结构。在第278~352位氨基酸残基这个区域内每个β阶梯结构域末端包含4股中枢β阶梯,一个小3股β折叠和3个二硫键。3ns1在细胞内复制NS1在病毒复制中确切的功能目前不清楚,证实NS1是病毒RNA复制中一种必需的辅助因子。在Vero和C6/36细胞内发现同细胞膜相关的二聚体NS1聚集在病毒感染细胞浆内囊泡中的病毒RNA复制位点附近,位于内质网衍生的小泡膜的腔侧,可能同和跨膜蛋白NS4A和NS4B相互作用构成复制复合物,在RNA复制早期锚定复制复合物到胞膜上,参与病毒RNA复制。4ns1在宿主免疫反应中的作用疾病急性期间,DENV感染动物模型和人体血浆中检测到sNS1蛋白,在DENV感染病人血浆中能够检测到浓度可高达50μg/mL。目前不是很清楚NS1功能,该蛋白通过多种不同的途径参与宿主免疫反应。在机体中能够诱导保护性免疫,也能诱导潜在的致病性的免疫反应。免疫DENVNS1蛋白、DNA或注射抗NS1抗体能够保护小鼠免受病毒冲击,同时其可诱导自生免疫性抗体同血小板和细胞基质蛋白反应导致血小板功能不全、出血、内皮细胞凋亡和免疫活化,也可通过同补体蛋白和多种细胞蛋白直接作用,参与登革病毒的致病机制。4.1denv感染期间ns1蛋白表达免疫机制根据当前研究,NS1诱导的保护性免疫很明显是多因素的。抗NS1抗体介导和补体介导的细胞吞噬作用在其中起着作用。此外,NS1相关的保护性免疫包括能够分泌抗病毒细胞因子的CD4+T细胞和识别杀死表面存在MHCI分子相关的NS1表位的感染细胞的CD8+T细胞。NS1蛋白不是一种病毒结构蛋白,抗DENVNS1没有中和活性但是注射抗DENVNS1抗体能够保护宿主免受同型病毒冲击。这种保护能力同能够固定补体NS1抗体有一种直接的关联,暗示抗NS1保护免受病毒侵袭最可能的机制是在抗NS1结合感染登革病毒细胞表面的mNS1,通过补体介导的调理作用融解感染病毒细胞。抗NS1单抗也能够通过抗体介导的吞噬作用保护小鼠免受同型病毒侵袭,其机制为抗体FC受体I和(或)IV识别细胞表面NS1结合IgG2a亚型抗体清除感染病毒细胞。免疫纯化的NS1蛋白产生的保护性免疫主要体液免疫反应,能够部分保护免疫小鼠免受同型病毒侵袭。该结果同以前小鼠被动注射抗NS1抗体通过结合补体成分保护动物免受颅内接种病毒冲击相一致。此外,以DNA为基础的NS1疫苗研究表明DENVNS1诱导保护性免疫除了体液免疫外也包含细胞免疫,这两种免疫反应均在保护宿主免受病毒侵袭中起作用。DEC205+的树突状呈递细胞群呈递NS1蛋白表位能够赋予CD4+和CD8+T细胞介导的保护性免疫,其诱导细胞免疫保护性免疫机制包括能够分泌抗病毒细胞因子的CD4+T细胞和识别杀死表面存在MHCI分子相关的NS1表位的感染细胞的CD8+T细胞。当前以全病毒或结构蛋白为基础构建的登革疫苗都难于诱导均衡、持久的同时针对四个血清型DENV保护性抗体,存在类似初次感染产生的增强感染风险。在疫苗设计采用非病毒结构蛋白免疫原的可防止生成病毒反应性的抗体,从而避免潜在的ADE危险性。阐述DENV感染期间NS1蛋白诱导保护性免疫机制,将可用于设计以NS1为基础的疫苗组成,诱导产生相似的保护性免疫反应。当前重新燃起对NS1蛋白作为针对登革病毒和其他黄病毒属病毒二代亚单位疫苗兴趣。很多策略用于研究NS1作为一种候补疫苗,包括直接采用天然或重组蛋白亚单位、裸露DNA和多肽为基础的等多种方式。研制NS1作为一种可用的疫苗候选并非没有明显的障碍,主要的妨碍是后文所述的NS1蛋白在诱导保护性抗体反应同时也能诱导同血小板和细胞外基质交叉反应的自身抗体,结合和诱导内皮细胞损伤。通过鉴定NS1蛋白表位,剔除明显诱导自身反应抗体位点能够较好解决这一问题。任何一种NS1为基础的疫苗均需要一定程度上避免诱导自身免疫性抗体,进一步的鉴定保NS1蛋白保护性表位是下一步研究的方向。在登革病毒感染中,sNS1表现出能够直接活化补体,同时抗NS1结合的感染细胞表面mNS1后,感染病毒细胞直接受到补体攻击,紧接着产生的攻膜复合体触发吞噬细胞活化,炎症细胞因子分泌及其伴随的可溶性的攻膜复合体可能参与严重登革疾病DHF/DSS的发病机制。病人血浆中可溶性的攻膜复合体浓度同sNS1浓度具有相似的变化曲线,同疾病严重程度相关。NS1也能直接同能够抑制补体攻膜复合体形成的补体抑制因子丛生蛋白结合,导致循环中游离的丛生蛋白减少,由此导致感染病人血清中可溶性攻膜复合体形成增加。但是在登革二次感染病例中二次感染患者中由于记忆性交叉反应性抗NS1浓度迅速升高,游离sNS1很快从血浆中消失,出现游离NS1浓度变化同疾病严重程度不一致的现象。因此,在登革病人中补体活化产物可能更有助于预测严重疾病后果。NS1可能通过抑制补体经典或旁路途径表现出一种免疫逃逸功能。sNS1能同补体蛋白CIs/C1s前体和C4结合,导致C4裂解为C4a和C4b增加,同时sNS1也能同C4b结合,由此保护病毒免受补体中和。NS1蛋白液也能同补体调节蛋白C4结合蛋白(C4BP)结合,展示出抑制补体经典通路和旁路活化一种新机制:NS1同C4BP结合能够导致C4BP募集因子I介导溶液中C4b裂解,此外细胞表面上沉积的sNS1-C4BP复合物能够导致细胞表面和C4b结合失活,由此保护感染细胞免受补体介导的溶细胞作用。4.3dhf/sss与ns1蛋白自身免疫反应当前DHF和DSS致病的细胞和分子机制仍需进一步阐述,认为同NS1诱导自身免疫反应相关。在DHF/DSS病人血浆中抗血小板和抗内皮细胞等自身免疫性抗体滴度明显高于DF病人。感染DENV临床分离株的小鼠血浆中具有很高的滴度抗NS1,表现出明显的凝血功能缺陷。以上现象提示抗NS1可能同严重的登革感染病人中观察到的出血现象有关。DHF/DSS临床特征也可能同同自身免疫引起的内皮细胞损伤相关。在体外实验抗NS1表现出同细胞外基质、血凝固相关蛋白和整联蛋白/黏附蛋白、血小板以及内皮细胞上的ATP合酶β链、二硫键蛋白异构体、波形蛋白和热休克蛋白等[17,30,32,34,35,36,37,38,39]宿主细胞成分反应。登革病毒NS1蛋白同人凝血整联蛋白和内皮细胞表面蛋白具有相同的表位,NS1中保守ELK/KLE基序广泛存在于不同的哺乳动物蛋白中,因此,抗NS1蛋白的抗体能够同宿主蛋白交叉反应,由此导致宿主组织的自身免疫性损伤。NS1蛋白及其抗体均能同内皮细胞表面结合,因此,作为内皮细胞损伤第一条途经可能是,结合在内皮细胞表面的NS1可能是抗NS1单抗结合的靶位,抗体同NS1蛋白形成的抗原抗体复合物结合触发补体活化,导致细胞损伤。NS1损伤细胞第二条途经可能是抗NS1同内皮细胞表面蛋白交叉反应,诱导细胞产生一氧化氮。产生的NO可能引起p53和Bax基因上调,Bcl-2和Bcl-xL基因下调,导致细胞色素C释放,天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶通路活化,由此引起内皮细胞凋亡。内皮组织限制血浆和血细胞向外渗透,内皮细胞损伤、死亡和破裂后能够观察到同DSS病例中观察到类似的渗漏现象。DFH/DSS中涉及到NS1蛋白重要的自身免疫性反应是抗NS1同血小板和凝血级联相关蛋白结合,抗NS1能够识别血小板上蛋白质二硫化异构酶抑制血小板聚集。此外,这些抗体也表现出能够识别凝血酶原和凝血酶,抑制凝血酶原活化。抗NS1能够同人血小板结合,抑制血小板聚集,引起出血,而切除蛋白羟基末端区域后免疫小鼠血清有效的降低这些效应。以上众多的研究提供在体内和(或)体外交叉反应性抗NS1同血小板和内皮细胞结合,从而继发细胞损伤和炎症活化证据,但是以上现象均在体外实验中观察到,可能不一定同登革感染病人体内情况相符合,例如,不能解释在DHF/DSS康复病人中出现的情况,登革病人由NS1诱导的自身抗体被认为在二次感染所致以内皮细胞功能不全和持续血管渗漏为特征的DHF/DSS发病机制中起着主要的作用,血管渗漏症状恢复的康复病人中并没有出现与血浆中抗NS1的突然下降的现象。而在这些康复病人中其血管通透性经常自然而然的快速逆转,暗示DHF/DSS病人中其血管内皮细胞损伤是可逆。同时出现这些具有破坏性自身免疫抗体在DHF/DSS疾病康复恢复期患者体内循环中持续存在而不会导致明显血管损伤矛盾的现象。此外在幼儿初次感染所致的DHF/DSS病人中,疾病急性期病人体内没有发现高水平的抗NS1。因此,这些自身反应性抗NS1可能在登革感染病人的发病中起一定的作用,需要在广泛的其他调节宿主和病毒的危险因素的环境中考量这些抗体作用。denv基因重组蛋白的结构和功能综上所述,DENVNS1蛋白由3个结构域组成,含多种重要的B淋巴细胞和T淋巴细胞表位。该蛋白是一种主要致病