火龙果中多糖的提取及抗氧自由基的研究

火龙果中多糖的提取及抗氧自由基的研究

糖是自然界最常见的物质之一。这是一个与人类生活密切相关的生物分子。大量药理及临床研究证明,多糖有免疫促进、抗肿瘤、抗肥胖、控制血糖、降血脂、抗衰老、抗凝血等生理功能,作为绿色生物医药产品具有广阔的市场前景。研究发现植物多糖具有调节免疫、抗肿瘤、抗病毒和抗氧化的多种活性,其中抗氧化的主要机制与自由基清除等作用有关。在某些病理情况下,由于自由基具有很高的反应活性,因此它将在分子、细胞乃至器官水平给机体造成损伤,从而加快机体的衰老过程,并可诱导癌症、心血管疾病等的发生。八角(staranise)为木兰科(Magnoliaceae)八角属(Illicium)植物八角茴香(IlliciumverumHook.f.)的果实。《本草求真》:“大茴香,据书所载,功专入肝燥肾,凡一切沉寒痼冷而见霍乱。寒疝、阴肿、腰痛,及干、湿脚气,并肝经虚火,从左上冲头面者用之,服皆有效。”八角主治寒疝腹痛、腰膝冷痛、胃寒呕吐、脘腹疼痛、寒湿脚气等,具有强烈香味,有驱虫、健胃、祛寒、兴奋神经等功效。八角的化学成分较复杂,主要含有茴香油、脂肪油、蛋白质、多糖及苷、酚类等。目前,对八角多糖的提取工艺研究相对较少,且对其多糖抗氧自由基的研究尚未见报道,限制了对八角进一步开发利用的可能性。因此,本文研究了其新活性成分多糖的抗氧自由基活性作用,为相关新药的开发和应用提供理论依据。1材料和机器1.1试剂的制备八角果实(采自广西柳州)。无水乙醇、氯仿、正丁醇、活性炭、硫酸、苯酚、盐酸、邻苯三酚、双氧水、硫酸亚铁、水杨酸等,均为分析纯试剂。葡萄糖标准品(J&KCHEMICALLTD)。1.2仪器和实验设备架盘药物天平(HC·TP12A-1,北京医用天平厂);电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司);电热恒温旋风干燥箱(DHG-9070A型,上海精密设备有限公司);电热式恒温水浴锅(箱)(江苏金坛宏凯仪器厂);循环水真空抽气泵(上海嘉鹏科技有限公司);旋转蒸发器(RE-52AA,上海安亭实验仪器有限公司);恒温磁力搅拌器(78WH-1,杭州蓝天化验仪器厂);紫外分光光度计(722N,上海精密科学仪器有限公司);紫外分光光度计(UV755,上海精密科学仪器有限公司)。2方法2.1滤渣的提取时间称量八角干品粉末223.5g置于蒸馏烧瓶中,加蒸馏水于室温中浸泡30min后,置于恒温水浴锅80℃加热提取过滤,滤渣反复提取2次,每次提取时间分别为3h、2h。合并2次滤液,用旋转蒸发仪蒸发浓缩至一定体积,再加入3倍体积的无水乙醇密封,静置一夜后抽滤,滤饼即为八角多糖粗品。2.2生产产物的制备将八角多糖粗品置于烧杯中,用一定量蒸馏水充分溶解后加入适量活性炭,于80℃水浴锅中搅拌30min后过滤,重复脱色2次,得脱色后的八角多糖粗品溶液。2.2.2蛋白质除除剂的制备加入相当于前一步骤所得八角多糖粗品水溶液1/4体积的氯仿,再加入相当于氯仿1/4体积的正丁醇,将混合物剧烈震荡约30min,离心。通过分液漏斗除去水层和溶剂层之间的变性蛋白,如此重复几次,直至将蛋白质充分除尽。将除去蛋白质的八角多糖溶液用恒温磁力搅拌器浓缩成膏状后,用电热恒温旋风干燥箱烘干,即得八角多糖样品。2.3苯酚溶液的配制(1)精密量取12.50mL苯酚,置于250mL容量瓶中,加蒸馏水定容,得5.0%苯酚溶液。(2)精确称取0.010g葡萄糖,置于100mL容量瓶中,加蒸馏水定容,得0.1mg/mL葡萄糖溶液。2.3.2样品溶液的制备精确称取0.011g八角多糖样品于小烧杯中溶解后移至100mL容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度,即为待测样品溶液。2.3.3对照品溶液的制备依次精密量取葡萄糖对照标准溶液5.00、10.00、20.00、30.00、35.00mL,分别置于50mL容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度,分别稀释成10、20、40、60、70μg/mL的5个不同浓度的对照品系列溶液;精密量取1.00mL对照品液5份,分别置于5个具塞试管中,加1.50mL苯酚溶液,再加7.50mL浓硫酸溶液,混合均匀后放置20min,用722N型可见-紫外分光光度计在486nm波长处测其吸光度,以对照品浓度c为横坐标,吸光度A为纵坐标做标准曲线,建立回归方程,结果见表1和图1。2.3.4回归方程精确称取八角多糖0.218g置小烧杯中溶解,移至100mL容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度。再精密量取1.00mL于另一个100mL容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度,得样品液。精密量取该储备液1.00mL,按照标准曲线项下的方法在486nm波长处测定其吸光度,根据回归方程计算出多糖中葡萄糖的浓度,再按下式计算出换算因子。校正因子的计算公式:式中:c为曲线回归方程计算浓度,μg/mL;D为储备液的稀释倍数;W为所取多糖样品质量(g)。测定吸光度A=0.144,则由回归方程和上式公式计算得校正因子F=5.74(n=3)。2.3.5多糖含量的测定精密吸取样品溶液1.00mL,同时重复3次按照标准曲线项下的方法在486nm波长处测定其吸光度,根据回归方程和以下的含量计算公式计算出样品中多糖的百分含量。其测定结果如表2。式中:c为曲线回归方程计算浓度,μg/mL;D为样品溶液的稀释体积;F为校正因子;W为所取多糖样品的质量(g)。2.4清除oh的实验大量研究表明,羟基自由基(·OH)具有极强的氧化能力,能导致生物体内DNA、蛋白质和脂质氧化损伤,对生物组织产生极强的危害作用。本文通过Fenton法研究八角多糖对羟基自由基(·OH)的清除作用。用Fenton反应法产生羟基自由基(·OH)。H2O2/Fe2+体系可通过Fenton反应产生经自由基化学反应如下:用·OH氧化水杨酸产生有色物质,该产物在510nm处有强吸收峰,若体系中加入清除·OH的物质,则会减少有色物质的生成,吸收度降低。吸光度越低,清除·OH效果越好。测量过程:取6支试管并依次编号为1、2、3、4、5、6。每支试管各加9mmol/LFeSO41mL,9mmol/L水杨酸-乙醇溶液2.00mL,再按编号1~5号试管各加不同浓度的八角多糖溶液2.00mL,6号管加2.00mL蒸馏水作空白对照,最后加入8.8mmol/LH2O22.00mL启动反应,在室温下反应1h。以蒸馏水作参比,于510nm处测定其吸光度,并与空白对照液比较,便能测定被测物对OH·的清除效果。其结果见表3和图2。其清除率计算式如下:式中A0为空白对照液的吸光度;AS为加入提取液后的吸光度。2.4.2邻苯三酚自氧化曲线的测定研究证明,超氧阴离子是一种强氧化性的自由基,有细胞毒作用,能与其它自由基结合进一步对生物组织产生毒害作用,因此研究八角多糖对超氧阴离子自由基的清除作用在生物损伤方面有着重要意义,本文通过Fenton法研究八角多糖对羟基自由基(·OH)的清除能力。(1)不加八角多糖样品溶液邻苯三酚自氧化曲线的测定:取缓冲液(Tris-HCl缓冲溶液,pH=8.2)4.50mL,加入4.20mL蒸馏水,混匀后在25℃水浴中恒温20min,取出后立即加入在25℃水浴中预热过的3mmol/L邻苯三酚0.30mL,混匀后立即倒入比色杯,于特征波长321nm处测定吸光度随时间的变化曲线,得邻苯三酚自氧化曲线。结果如图3所示。(2)加入多糖样品后邻苯三酚自氧化曲线的测定:依上法实验,在加入邻苯三酚前先加入1.00mL的八角多糖溶液,再加入3.20mL蒸馏水,混合均匀后在25℃水浴中恒温20min,取出后立即加入在25℃水浴中预热过的3mmol/L的邻苯三酚0.30mL,混匀后立即倒入比色杯,于特征波长处测定加入八角多糖样品后邻苯三酚自氧化曲线。其结果如图4、图5和图6所示。根据邻苯三酚自氧化曲线在线性范围内每20s吸光度的增加(用线性回归法求得)即反应速率V,清除率计算如下:式中:V为加入多糖样品溶液后反应速率,V0为不加多糖样品溶液时邻苯三酚自氧化速率。3结果与分析3.1葡萄糖浓度和吸光度的线性关系由表1可求得回归方程如下:A=0.0161c+0.0418,相关系数r=0.9979,说明葡萄糖在所取浓度范围内其浓度和吸光度呈良好的线性关系。根据回归方程由八角多糖含量计算公式和表2可计算得出八角多糖样品中纯多糖含量为:1.34%。3.2生产体系的用量由表3和图2可见,不同浓度的八角多糖对H2O2/Fe2+体系通过Fenton法反应产生的·OH都具有清除作用,且随浓度的增加,清除率不断升高,即清除率与八角多糖的用量存在一定的量效关系。在低浓度时,随浓度的增加,清除率明显升高。3.3八仙糖去除超氧离子的作用3.3.1是否有幅度不同的情况下,做有力度不同的品种由图3可看出加入八角多糖样品前后的邻苯三酚自氧化反应曲线变化趋势相同,但变化速度和幅度不同。很明显,加入多糖样品后,A321值达到最高值时间均有不同程度的提前,说明八角多糖样品的加入可加速邻苯三酚自氧化反应的进行,推测这可能是因八角多糖对O2-·具有清除作用,使反应体系中O2-·浓度减小,从而加速了邻苯三酚自氧化反应的进行。3.3.2不同浓度抗氧化性分布中多糖的清除率s由图4、图5、图6可知各回归曲线的斜率在数值上等于反应速率V,则:0.218μg/mL多糖的清除率S=(V-V0)/V0=16.7%;15.26μg/mL多糖的清除率S=(V-V0)/V0=33.3%。从图4、图5、图6可知,不同浓度的八角多糖对邻苯三酚自氧化产生的超氧阴离子O2-·具有清除作用,在2.18μg/mL多糖浓度时达16.7%,而在15.26μg/mL时就达33.3%。可见在一定范围内,清除率随多糖浓度的增加而不断提高。4抗氧自由基药八角经提取纯化后所得的多糖样品中纯多糖的含量为1.34%,另外,八角多糖对O2-·自由基和·OH自由基的清除作用均较强,具有明显的抗氧自由基能力。大量研究已表明,过多的活性氧自由基会对人体有破坏行为,导致人体正常细胞和组织