中华鳖精子头发育超微结构的变化

中华鳖精子头发育超微结构的变化

动物的超微结构研究主要集中在牛奶和昆虫上，其他动物的实验报告相对较少。不同种类的动物,其精子发生的形态变化过程存在差异,精子细胞的变态机制争议更大。关于爬行动物精子形成的研究,有鳞目的蜥蜴类和蛇类已有报道,但龟鳖目精子发生的变态过程描述很少。中华鳖是我国养殖最广泛的水生爬行动物,具有重要的经济和药用价值,尤其最近有人开始了中华鳖的繁殖生物技术的研究,需要对中华鳖的精子特性和生殖细胞的形成过程进行详细诠释。精子头部主要包括细胞核和顶体,是精子结构和功能的最重要部分。本实验室曾观察了中华鳖成熟精子的结构特性,发现中华鳖的精子形态与其他爬行类差异明显。本文进一步应用透射电镜技术,观测了中华鳖精子头部形成过程的超微变化规律,并与其他动物进行比较,为深入研究动物精子发生的变态机理和中华鳖的生殖生物学特性提供形态基础。1睾丸的制备和重建2005年9月25日,10只中华鳖购自南京市惠民桥水产市场,均为人工池塘养殖2—3龄的性成熟雄鳖,650—800g/只。此期均在繁殖季节,健康状态良好,买来后立即宰杀,掀开腹甲,每只任选一侧睾丸切取组织块。将睾丸组织修切成1mm3小块,固定于2.5%戊二醛PBS液中,4℃过夜,PBS洗涤,1%锇酸后固定1h,上行梯度酒精脱水,至100%乙醇后,丙酮置换,Epon812包埋。LKB切片机超薄切片,醋酸铀和柠檬酸铅染色,JEM-100CXII型透射电镜观察并拍照。2结果2.1均匀微细的粒度中华鳖精子细胞核呈饱满的圆球形,位于细胞中央,染色质为均匀细小的颗粒状(图版I:1,2),着色淡,核大小约为2.8μm×3μm。胞质内圆形线粒体稀少,线粒体嵴为板状。滑面内质网为平行排列的扁囊状(图版Ⅰ:1)。2.2第期核型核的发育与发育精子头部的形成过程的形态变化主要包括顶体的形成、细胞核浓缩以及细胞核拉长变细。根据不同阶段的主要形态事件,本实验将中华鳖精子头部的形成过程分为5个连续时期:第Ⅰ期精子细胞开始变态时,由高尔基复合体分泌形成的前顶体泡移动到细胞核一侧(图版Ⅰ:1),泡内含有非均质状物。前顶体泡同侧的细胞核膜变平坦(图版Ⅰ:1),并与前顶体泡接近。随后,平坦的核膜逐渐向内凹陷,前顶体泡不断变大,并嵌于核膜凹陷内(图版Ⅰ:2)。前顶体泡内变得清亮,高尔基复合体始终位于其附近。胞核凹陷稍加深,但最终呈一浅窝(图版Ⅰ:2—6)。细胞核开始向精子细胞一侧移动,移动时前顶体泡在前端。同时圆形的细胞核开始变形,呈前端窄小后端宽大的梨形(图版Ⅰ:3,4)。前顶体泡底部中央出现一个电子致密的小颗粒,为顶体颗粒(图版Ⅰ:4)。顶体底部与细胞核之间产生一薄层纤维物质层(图版Ⅰ:4),此纤维物质层不断增厚并致密(图版Ⅰ:5—8)。高倍电镜下,于纤维物质层胞核一侧的中央,正对着顶体颗粒有一更小的顶体下颗粒(图版Ⅰ:5)。随后,顶体下颗粒消失,但核前端中央继而出现一条短的致密带(图版Ⅰ:6)。致密带逐渐向后延长(图版Ⅰ:8),并可增至2—4条(图版Ⅱ:9),将发育成为核内小管。第I期细胞核染色质与精子细胞核一样,一直呈均匀细小的淡染颗粒(图版Ⅰ:3,4),此时核大小约2.6μm×3μm。第Ⅱ期细胞核凹窝向外隆突(图版Ⅰ:7),推动并顶压前顶体泡由圆形逐渐变扁,此过程由凹窝中央波及周围,最终使得顶体囊覆盖于核前端(图版Ⅰ:8),内外两层顶体膜平行排列,形成顶体帽。同时,顶体颗粒在扁囊状的顶体内弥散开来,使原来清亮的前顶体泡变成中等电子致密物(图版Ⅰ:7,8,图版Ⅱ:13,15)。细胞核进一步端移和拉长。顶体帽外膜与精子细胞膜接近,而顶体帽内膜底部与细胞核之间的纤维物质层增厚且变得更致密(图版Ⅰ:8,图版Ⅱ:9),将来形成顶体下锥(图版Ⅱ:15—18)。顶体帽内外膜之间腔隙狭窄,但顶体帽后端略膨大,与核肩相接(图版Ⅰ:8)。核内染色质开始浓缩,由原来淡染的细小颗粒逐渐融合成粗大致密的颗粒状(图版Ⅱ:10—12),颗粒之间的间隙清亮明显,但颗粒与颗粒之间有细丝相连,形似结晶状(图版Ⅱ:10)。由于染色质浓缩,细胞核体积变小,核膜与核质之间出现间隙,双层核膜也变得松弛弯曲(图版Ⅱ:11),但未见核膜消失和再生现象,此时核大小约为3.2μm×1.1μm。核周围出现微管组装,这些微管围绕细胞核,形成环形核套结构(图版Ⅰ:8,图版Ⅱ:11,13)。在细胞核的纵切面上,环形核套微管被横切而呈细小泡状(图版Ⅰ:8);相反,在细胞核的横切面上,环形核套微管则被纵切而呈细管状(图版Ⅱ:11)。高倍电镜下,核套微管之间有短桥相连。第Ⅲ期细胞核变得前尖后宽,核后端凹陷形成植入窝,中心粒移入此处(图版Ⅱ:12),将参与颈部的结构发育。细胞核更加浓缩,染色质颗粒间隙变小。在顶体下端,细胞膜与核膜紧贴(图版Ⅱ:13),将来发育成顶体后环。环形核套微管在顶体后环之后环绕细胞核排列(图版Ⅱ:13)。胞核继续拉长,前端有顶体覆盖的部分已经凸出于精子细胞外,而大部分细胞质向后拖(图版Ⅱ:13),核大小约为3.3μm×0.7μm。第Ⅳ期致密而粗大的染色质颗粒相互融合,颗粒间隙逐渐消失,致使细胞核浓缩成电子致密的均质状(图版Ⅱ:14—18)。在顶体周围和前端,支持细胞的突起形成特殊的“袖领”结构并包绕顶体(图版Ⅱ:15,16),或者说精子顶体插入到支持细胞突起形成的“袖领”中。在细胞核的斜切面上,可见核周围原来环形排列的核套微管变成斜行分布(图版Ⅱ:14),随后斜行微管又沿细胞核长轴方向纵向排列(图版Ⅱ:15,图版Ⅰ:3),形成纵行核套。此时,细胞核前部变得窄细并向前延伸,形成核前突,其表面直接与顶体下锥相接(图版Ⅱ:15—18),此时核体积进一步缩小,大小约为2.7μm×0.4μm。核前突基部变宽,为核肩。第Ⅴ期纵行核套消失,顶体前端特殊的“袖领”也随之退缩(图版Ⅱ:17,18),顶体帽与顶体下锥的形状与核前突对应,顶体下锥紧密覆盖核前突,其顶端宽厚,两侧由上而下逐渐变薄(图版Ⅱ:17),并与顶体帽后端一起止于核肩。顶体帽与顶体下锥之间出现狭窄的顶体下间隙。核内小管发育明显,向前伸出核前突的前端,与顶体下锥连接(图版Ⅱ:17),向后伸达胞核长度的2/3,经常见到2条或多条核内小管排列(图版Ⅱ:18),此时核拉长完成,大小约为2.7μm×0.3μm。精子头部基本发育成形后,尾部随之形成(图版Ⅱ:19)。3讨论3.1精子骨锚类型与鸟类相似性精子形成过程中,头部细胞核的变化主要表现在细胞核的拉长变形和核质的浓缩两个方面。两栖类泰国叶蛙(Thaileaffrog,Megophrysmontana)和中国雨蛙(Hylachinensis)精子发生过程中,细胞核周围未见核套形成。但鸟类精子形成时出现了微管构成的核套,而且不同的报道存在一定差异。公鸡(Gallusdomesticus)精子形成过程中,精子细胞核周围出现了环形核套微管,而美洲鸵鸟(RheaAmericansalbisceus)精子细胞变态时,精子细胞核周围先形成环形核套,后出现纵行核套,而且在两种形式核套之间还发现过渡的斜行核套。核套具有一定紧缩力,有利于精子细胞核的拉长和变细。在爬行动物中,有鳞目的北草蜥(Takydromusseptentrionalis)、渔游蛇(Natrixpiscator)和赤链蛇(Dinnodonrufozonatum)精子细胞内没有观察到核套,只是在支持细胞中观察到纵行排列的微管束,更未见环形和斜行核套出现。龟鳖目中,龟类核套的情况未见报道。中华鳖精子形成时,先后出现环形(图版Ⅱ:11)、斜行(图版Ⅱ:14)和纵行(图版Ⅱ:15)核套,这些核套是由平行排列的微管束构成。可见,在精子头部变形过程中,中华鳖出现核套的情况与鸟类相似。近年来,在动物系统发生研究中,通过分析mtDNA和22种核基因序列数据,把龟鳖类和鳄类列在一起,与鸟类亲缘关系接近,而把有鳞目放在爬行类系统发生的基部,与两栖类亲缘关系接近。这也得到了本实验的部分形态学支持。3.2形态变化对精子细胞核的影响两栖类中国雨蛙精子细胞核内,颗粒状染色质首先聚集成卷曲的柱状结构,随后卷曲伸直,形成精子头部。在此过程中,核膜数次更新,核内浓缩出的多余物质渐次从核中排出,致使细胞核达到浓缩的目的。鸟类的美洲鸵和公鸡精子细胞核的变化过程与雨蛙明显不同,核质浓缩过程未经过柱状体的卷曲状结构,核膜也没有发生更新,两者的染色质没有形成粗大颗粒的形式。已有的爬行动物研究中,有鳞目的北草蜥和渔游蛇精子细胞核染色质浓缩成颗粒状,而且颗粒的形态属于纤维型,呈长棒状的纤维颗粒,沿拉长的细胞核纵轴有序排列,最后这些颗粒浓缩并融合成均质致密状。中华鳖精子细胞核浓缩时,虽然染色质也形成颗粒状,但这些颗粒并非纤维状,而是呈大小基本一致的圆形(图版Ⅱ:11,12),而且颗粒之间有许多细丝相连,形似冰晶状(图版Ⅱ:10)。随着染色质的进一步浓缩,中华鳖染色质颗粒间隙变小,直至间隙消失,核质呈均质状。核质与核膜之间出现明显间隙,核膜也变得松弛弯曲,但未见核膜的消失与再生现象发生。这表明,精子细胞核浓缩的形态变化过程中,不同纲动物之间存在明显差异,两栖类和爬行类的染色质出现明显颗粒化过程,而且颗粒的形状也不同。关于细胞核浓缩的机械原理,McIntosh(1967)认为公鸡精子细胞核周围的环形核套可以提供一种机械力,挤压细胞核内容物,引起细胞核浓缩。但有些鸟类(Crotophagaani)的精子形成过程中,精子细胞中没有核套微管出现,而它们的支持细胞中分布着丰富的微管束,将承担机械收缩力的作用。美洲鸵鸟的精子发生过程中出现典型的核套,但并不认为核套与核质浓缩有关,而是可能具有其他功能。在两栖类,研究泰国叶蛙精子形成时,发现在没有核套微管的条件下染色质仍能完成浓缩过程,它们的核浓缩是通过核内低电子密度物质连同多余旧核膜一起排出来实现。更有人通过果蝇(Drosophilamelanogaster)突变体实验和秋水仙素或抗微管抗体抑制微管实验,发现在没有微管的情况下,细胞核虽然不能拉长,但可以完成浓缩过程。可见,精子形成过程中核浓缩的机械力,在不同的动物得出的结论不一致,有的来自精子细胞本身的核套,有的来自相邻支持细胞的微管束,还有的是精子细胞核内部的作用所致。本实验观察中华鳖精子细胞核变形时,环形核套的出现与染色质开始浓缩的时间基本同步(图版Ⅰ:8),随着环形核套进一步的发达完善,核内染色质更加浓缩(图版Ⅱ:11,14)。当环形核套逐渐向斜行发展时,核内染色质也高度浓缩成致密的均质状,颗粒间隙消失(图版Ⅱ:14)。细胞核浓缩过程完成时,核套微管也完全由环形改建为纵行,沿细胞核长轴平行排列(图版Ⅱ:15),此后细胞核进一步拉长变细,最终成为精子头部主要结构(图版Ⅱ:17)。从此过程中我们可以看出,环形核套出现与核内染色质的浓缩时间和浓缩状态基本吻合,而且当染色质浓缩完成时,环形经过斜行改建成纵行核套,直至精子细胞核完成拉长变形后,纵行核套消失(图版Ⅱ:17)。从形态变化过程我们可以推测,中华鳖精子形成过程中,环形核套除了与细胞核变细拉长有关外,还为染色质浓缩提供机械收缩力,促进核质浓缩;斜行核套是环形核套向纵行核套改建过程的一种过渡形式;纵行核套可以产生紧束力,参与细胞核拉长和最后形态的形成。近些年来,人们从分子生物学水平开始研究哺乳动物精子细胞细胞核浓缩的分子机制。精子形成过程中伴随精子细胞核浓缩,核蛋白类型发生明显改变。早期精子细胞及其以前的生精细胞的核蛋白为组蛋白,富含赖氨酸。当圆形精子细胞伸长时,组蛋白由过渡蛋白(transitionalprotein)取代,到晚期精子细胞阶段,富含精氨酸和胱氨酸的鱼精蛋白又逐渐替代了过渡蛋白。鱼精蛋白的作用主要是中和DNA的电荷,降低DNA分子间的静电排斥,并使染色质高度浓缩,同时其分子中的胱氨酸可形成分子内或分子间的二硫键,使浓缩的核更稳定。这种哺乳动物精子细胞核浓缩的分子机理是否相适用于中华鳖,有待于进一步的研究。3.3顶体颗粒的观察和观察关于爬行动物顶体的形成过程,在蜥蜴类研究的比较多,而且各具特点。首先,在细胞核凹陷方面,斑鬣蜥(Agamastellio)精子顶体泡形成过程中细胞核先出现两个凹陷的顶体囊泡,后合并为一个大顶体囊泡,凹陷呈深杯状。而嵴尾蜥(Tropidurus)在核凹陷时整个顶体囊泡完全陷入在细胞核内。北草蜥和其他蜥蜴的顶体囊泡一半陷入到核中,另一半突出于核外,凹陷也呈深杯状。中华鳖精子形成时,细胞核一侧也产生凹窝,前顶体泡位于此处,但凹陷的深度要比上述动物的浅,第Ⅱ期凹陷向外突起而消失。其次,在顶体颗粒方面,其存在时间和数量在不同爬行动物间有差别。赤链蛇和北草蜥的顶体颗粒在第Ⅱ期一直存在,但嵴尾蜥和黑眉锦蛇(Elaphetaeniura)的顶体颗粒在第Ⅱ期则消失;西亚鬣蜥(Agamablandifordi)和短颈南蜥(Mabuyabrevicollis)的顶体囊泡中出现两个顶体颗粒,分别形成顶体帽中的电子致密层和半电子透明层。中华鳖的顶体颗粒只有一个,而且明显比其他动物要小,随着细胞核凹陷的前突和前顶体泡的变扁,顶体颗粒在顶体囊中弥散开来。但同样是龟鳖目,红耳龟(Pseudemysscripta)则未观察到顶体颗粒。可见,与其他动物相比,中华鳖顶体颗粒的大小和变化过程具有一定特殊性。3.4顶体下颗粒的变化爬行动物精子顶体的形成已有描述,但核内小管的发育过程未曾见报道。北草蜥在前顶体泡时期,顶体下颗粒出现,并将顶体颗粒与核膜连接起来。直到头部发育晚期核质浓缩