荧光定量r-pcr方法在登革病毒检测中的应用

荧光定量r-pcr方法在登革病毒检测中的应用

病毒登甲（dap）是一种急性昆虫传播感染的病原体，可导致登甲热（df）、登甲出血热（dhf）和登甲休克综合征（dds）。dhf和dds的死亡率很高。根据邓甲病毒的抗原性，可分为四种类型（d1.4）。在过去的40年里,登革热流行范围已遍及整个热带和亚热带地区,在除欧洲之外的所有大陆都有流行,已成为流行地区普遍关注的公共卫生问题。在我国,以往登革热主要在华南地区和台湾省流行,近几年随着国际交往的日益频繁,登革热在我国的流行范围不断扩大,流行频度也有所上升。2004年7-10月浙江省慈溪市突然发生疑似登革热暴发疫情,共报告登革热病例113例;同年10月,杭州市某医院接收一位曾在登革热流行区马尔代夫归国的登革热疑似病例,但经ELISA法检测登革病毒IgM与IgG抗体均为阴性。为迅速确定病原,我们建立了登革病毒1、2型的TaqMan荧光定量RT-PCR快速检测方法,对上述病因进行了快速、正确的实验室诊断,收到了很好效果,现将结果报道如下。1材料和方法1.1疑似病例标本上传登革病毒标准毒株1、2型由广东省疾病预防控制中心(CDC)馈赠,浙江省慈溪市登革热暴发疫情中疑似病例的血清标本及杭州市某医院采集的疑似病例血清标本由当地CDC送检。1.2同源性较好的ns5基因和2型c基因保守区的设计和改造从GenBank上下载几十株不同年份和地区分离的登革病毒1、2型核苷酸序列,用Bioedit软件进行同源性比较找到保守区,参考Johnny等在登革病毒1型的NS5基因和2型的C基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针,略作改动,碱基序列见表1。引物和探针均委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。1.3tcid50反应管的制备登革标准毒株采用C336细胞进行病毒效价滴定后(106TCID50ml)作为参考株,将其稀释至1000、100、10、1、0.1、0.01TCID50反应管。病毒RNA的提取采用德国QIAGEN公司的ReansyMiniKit,按试剂盒说明书提取。1.4引物与探针配比的确定为防止TaqMan荧光定量RT-PCR反应混合物中由于引物与探针之间的浓度不当而引起非特异性竞争抑制,选择引物与探针的最佳浓度配比。试验在相同浓度阳性核酸为模板的反应体系中,选用不同浓度范围的引物和探针,采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度。1.4.2浓度为mg2的优化Mg2+的浓度高低对Taq酶的活性与扩增的特异性密切相关,用相同浓度的登革病毒核酸作为模板,对Mg2+浓度进行优化。1.4.33m温度优化在同一浓度阳性核酸为模板条件下,采用荧光定量PCR仪上的温度梯度功能,在Tm值(45～65℃)下进行检测,选择最佳Tm温度。1.5pcr引物、taq酶和逆转录酶混合物depc的制备采用Roche公司的RT-PCR试剂盒进行,反应体系为20μl。其中5×RT-PCR缓冲液4μl,dNTP混合物(10mmolL)1.6μl,DTT(100mmolL)1.0μl,RNase抑制剂(5Uμl)0.4μl,20μmolL上游引物与下游引物各0.5μl,Taq酶和逆转录酶混合物(5Uμl)0.4μl,模板RNA10μl,最后用DEPC水补足至20μl。反应条件为50℃30min,94℃2min进行逆转录,然后94℃30s,55℃30s,68℃1min进行扩增,35个循环后转入68℃7min,取8μl产物进行电泳判断有无106bp(登革1型)和80bp(登革2型)的特异性条带。1.6taqman荧光定量rt-pcr检测提取流行性乙型脑炎(乙脑)病毒、肾综合征出血热(HFRS)病毒以及登革病毒3、4型等核酸,用建立的登革病毒1、2型TaqMan荧光定量RT-PCR系统进行检测,验证检测体系的特异性。同时对已标定TCID50的登革病毒稀释后分别提取RNA,平行进行TaqMan荧光定量RT-PCR与RT-PCR反应,比较其灵敏度。此外,对每一个浓度的病毒稀释液做5次重复检测,得到的Ct值采用Stata8.0软件计算标准差,验证检测体系的稳定性。2结果2.1pcr检测taq酶的表达RT-PCR试剂盒由Roche公司提供,反应体系为25μl。优化后各反应物的终浓度为:0.2mmolLdNTP混合物(each)、7.5mmolLMgCl2、0.5μlTaq酶和逆转录酶混合物(5Uμl)、10μl模板RNA、矩阵法优选后1、2型的引物和探针最佳浓度分别为0.8μmolL的引物浓度与0.48μmolL的探针浓度及0.6μmolL的引物浓度与0.4μmolL的探针浓度,最后用DEPC水补至25μl。用MJResearchOption2荧光检测系统或Rochelightcycle荧光检测系统进行检测,1、2型均按下列反应参数进行:45℃30min逆转录,94℃变性2min,以93℃15s,51℃1min扩增40个循环,在51℃进行单点荧光检测。2.2taqman荧光定量rt-pcr方法检测taqman荧光定量rt-pcr的最优特异性对乙脑病毒、HFRS病毒以及登革病毒3、4型等分别提取病毒RNA后,用建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法进行检测,登革病毒1、2型TaqMan荧光定量RT-PCR体系各自表现良好的特异性,与其他病毒间均无交叉反应。2.3taqman荧光定量rt-pcr检测对登革病毒1、2型标准毒株,采用C336细胞进行病毒效价滴定后(106TCID50ml),稀释成1000、100、10、1、0.1、0.01TCID50反应管,提取病毒RNA,分别用TaqMan荧光定量RT-PCR与常规RT-PCR方法进行检测,结果TaqMan荧光定量方法登革病毒1、2型均达到0.1TCID50,分别比各自常规PCR方法灵敏度高10倍左右,见图1,表2。2.4检测结果的重复性登革病毒1、2型标准毒株提取RNA后,按10倍梯度稀释成不同的浓度,对每一个浓度的样本做5个重复检测,结果登革病毒1、2型不同核酸浓度各自检测的Ct值标准差在0.23～0.65之间,具有较好的重复性。2.5登革热规模检测从浙江省慈溪市疑似登革热病例的血清标本中直接提取病毒RNA,用建立的荧光定量RT-PCR方法进行检测,结果证实慈溪市登革热暴发疫情为登革病毒1型所引起。此外,杭州市某医院的疑似病例当时血清登革热抗体检测为阴性,而荧光定量RT-PCR方法检测证实为登革病毒2型感染,1周后医院又采集第2份血清检测登革IgM抗体为阳性,这与本研究在7d前对第1份血清的检测结果完全一致(图2)。3荧光定量rt-pcr方法检测登革病毒的活性登革病毒的流行是热带、亚热带国家一个严重的公共卫生问题,全世界每年发生的登革热病例超过10亿,约有15亿人受到威胁。尤其由输入性病例引起的非疫区的登革热暴发与流行也屡见报道(此次浙江省慈溪市的登革热疫情就始于1例泰国输入性病例)。因此建立一种快速、准确的实验室检测方法对临床诊断和疫情控制具有重大意义。登革热的实验室诊断目前主要依赖病毒分离定型以及血清中特异性IgM、IgG抗体测定。虽然得出结果客观,但由于患者早期抗体阳性率低,往往要7-10d后IgM抗体才能达到一个较高的水平,因此在应急诊断中受到一定的限制。近年来,谢剑锋等报道采用逆转录-巢式PCR鉴定登革1型病毒,任瑞文等报道用多重逆转录PCR检测登革病毒,这些方法虽然能在发病早期进行检测,但存在着容易由污染造成假阳性的缺点。近年发展起来的荧光定量RT-PCR技术,实行完全闭管式操作,通过检测反应体系中的荧光强度动态变化对目的核酸进行实时定量分析,该方法比普通PCR更加准确、快速、灵敏、简便,并且减少了污染的环节,目前也被认为是登革病毒检测的最为有效的方法之一。登革病毒基因组的NS5区和C区基因区域既具有登革热的型特异性,又具有相当的保守性,本研究选取了登革病毒1型的NS5基因和2型的C基因的特异保守区分别设计合成了TaqMan荧光定量RT-PCR的引物和TaqMan探针,并用Blast验证了其型内的广谱性和型间的特异性,并经实验室证实该方法与登革病毒的4个血清型之间以及乙脑病毒、HFRS病毒等均无交叉反应。该方法在约3h(包括RNA提取)内能同时完成多个疑似患者临床样本的高通量检测,敏感度均达0.1TCID50,比普通PCR的灵敏度高10倍左右。本次杭州市某医院的疑似登革热病例当时用ELISA法检测病人血清IgM抗体为阴性,但用本研究建立的荧光定量RT-PCR方法检测登革病毒核酸为2型登革病毒核酸阳性。1周后再次采集患者血清检测也证实为2型登革病毒感染。随着我国经济的发展,对外交流日