登革病毒包膜e蛋白区denved3的结构与功能

登革病毒包膜e蛋白区denved3的结构与功能

病毒登格病毒（denv）是黄病毒属的一种单体正链rna病毒，以昆虫为手段，广泛分布于热带和亚热带地区。感染可引起普遍发热、登格热、严重的登格血热和登格斯坦病（dhf）、登格斯坦病（sds）和登格斯坦病（dhf）等疾病，严重危及人类健康。成熟的登革病毒颗粒直径约50nm,内部含感染性的单股RNA分子,长约11kb,含单一的可读框,首先翻译出一个含约3500个氨基酸残基的聚蛋白前体(NH2-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-COOH),而后被位于内质网腔中的宿主信号肽酶和病毒蛋白酶切割成3个结构蛋白(C、prM/M和E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。其中,包膜糖蛋白E为病毒包膜的重要组成部分,根据包膜E蛋白的抗原性不同,登革病毒可分为4个血清型(DENV1、DENV2、DENV3和DENV4),感染其中的任何一型均可产生对此种血清型病毒的终身免疫,但不同型之间的交叉保护性免疫较为短暂。其中,病毒感染产生的非中和抗体还可介导抗体依赖的感染增强现象(antibodydependentenhancement,ADE),即当初次感染某一型登革病毒产生相应抗体后,再次感染其它型别的登革病毒时,抗体或亚中和活性抗体非但不能起到中和病毒的作用,反而与登革病毒颗粒结合形成抗原-抗体复合物,通过与单核细胞或巨噬细胞膜上的IgG的Fc受体(FcR)结合,进入到这些细胞内进行繁殖,引起单核细胞系感染,随即释放出裂解补体C3的酶、血管通透因子和凝血活化酶,进而导致弥漫性血管内凝血、休克等一系列病理过程,导致严重的DHF和DSS的发生。E蛋白构成病毒颗粒的突起,具有介导病毒吸附、与宿主细胞膜融合、病毒组装、诱发中和抗体产生保护性免疫等多种重要的生物学功能。按照功能的差异,登革病毒E蛋白又分为I、II、III三个功能区(envelopeproteindomain,ED)(也称ED1、ED2、ED3),其中ED3具有免疫球蛋白样结构,是登革病毒与细胞受体结合的功能区域,决定着登革病毒感染的靶细胞种类,ED3结构的突变也将导致病毒毒力的减弱或使病毒逃逸于机体的免疫中和效应。因此,对登革病毒ED3的研究也是近年来关注的热点,通过对ED3的结构和功能研究,将有助于理解登革病毒与其敏感细胞间的相互作用和致病的分子机制,为在不同细胞上登革病毒病受体的筛选鉴定、特异性诊断、疫苗研究和抗病毒药物的设计等提供理论依据。本文就近年来国内外登革病毒包膜ED3的研究进展综述如下。1.denv3蛋白的结构登革病毒包膜E蛋白由495～501个氨基酸残基组成,分子量约为55～60kDa,现已获得DENV2和DENV3E蛋白的晶体结构,结果显示,登革病毒的E蛋白刺突是由两个单体分子以反向平行方式构成的同源二聚体,镶嵌于成熟的登革病毒颗粒表面,每个登革病毒成熟颗粒又由180个这样的同源二聚体E蛋白构成了病毒的表面突起。E蛋白可形成3个不同的结构域,呈β桶状的ED1,位于E蛋白单体中央,也称中心区;呈指样结构的ED2,参E蛋白二聚体的形成和病毒与宿主细胞的融合过程;ED3由E蛋白C端的第303-395位氨基酸残基构成且延伸至病毒的最表面,含有大量天冬氨酸及碱性氨基酸,它具有免疫球蛋白IgG样结构,其β桶状结构的中心轴与病毒表面垂直,并以一个15个氨基酸残基的短链与ED1区相连。Volk等对DENV4的可溶性ED3蛋白晶体的X-ray研究发现,ED3蛋白是一个由3组β片层排列成的β桶状结构,第一组β片层顶端的外表面暴露于病毒颗粒表面,包括β1、β2、β5和β7F306-E314残基位点(β1,凸起的309–312)\T320-Y326(β2),R350-I351(β5)a和V365-E370(β7),在一个E蛋白的二聚体中大约一半的这种片层结构与ED2上相对的蛋白质分子相结合。第二组β片层包括了β3和β6的残基位点C333-K334(β3)和L357-A358(β6),这组片层的外表面与ED1相对。第三组β片层包括β4、β8和v9位点的氨基酸残基F337-R340、D375-I380(β8)和L387-F392(β9),这组片层离病毒颗粒表面最远(图1)。所有的这三组β片层也存在于DENV2和DENV3的ED3蛋白结构上,但β5不同,DENV3(R348-L349)和DENV4(R350-I351)病毒的β5只有两个氨基酸长,而在DENV2上扭曲的β5(V347-L351)包含了N-末端上附加的三个氨基酸残基(图2)。在整个黄病毒属中,β1-9片层编码序列均高度保守,一个β片层穿过4个β片层,β8、β9穿过全部结构的现象在所有的黄病毒中均存在。Wang等在比较了森林动物登革病毒隔离株P75-215和人类登革病毒隔离株703-704后发现,在ED3上有5个氨基酸残基(K340R,M342V,I335T,I364V和A382V)的变异,推测这5个氨基酸残基的保守性变异可能导致了登革病毒从蚊到猴子的传播迁变为蚊到人的传播,也就是说人登革病毒的出现,部分由于ED3上重要氨基酸的改变,进而使病毒的受体结合性质发生了改变而造成的。2.denv2基因回复突变体的结构及生物学特性病毒感染细胞的前提是吸附细胞,其本质是病毒与细胞表面受体的特异性结合。现普遍认为ED3介导了病毒与细胞的结合,为细胞受体的结合位点,原因如下:ED3具有许多结合细胞受体特有的免疫球蛋白样折叠;ED3具有的loop环结构使它比ED1和ED2要远离病毒表面;不同可溶形式的ED3蛋白已被证实可以阻断西尼罗病毒和登革病毒对细胞的感染。运用分子单克隆抗体、酵母表面展示和对DENV2ED3的随机诱变等技术方法,现已描绘出DENV2ED3的部分中和表位K310、I312、P332、L389和W391,用相应的单克隆抗体封闭这些表位后,可降低DENV2对其敏感细胞的感染。登革病毒在不同细胞上的受体研究一直是登革病毒研究的热点之一,目前认为DENV受体包括蛋白质类、糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)、硫酸乙酰肝素(heparansulfate,HS)和与脂多糖连接的CD14相关分子等,其均与病毒和细胞的吸附有关,而由ED3参与的受体主要为GAG、HS和一些蛋白质分子。GAG是由二糖重复单位(氨基己糖、己糖醛酸或半乳糖)组成的线性杂多糖,其重复二糖骨架的化学结构广泛分布于多种哺乳动物细胞系中,如Vero、CHO等。Rostand等发现DENV2的吸附与病毒和表达在基质及细胞膜上的GAG结合有关。通过对其结合的序列分析得出:为于I区侧面、III区终端的E284-310位氨基酸和位于Ⅲ区尾部的E386-411位氨基酸具有2个GAG结合区,能够与细胞表面的GAG结合。实验证实用GAG裂解酶除去Vero细胞上的GAG后,病毒与细胞的结合率下降;DENV2与GAG表达缺陷的CHO细胞的结合率也比野生型有大幅下降。但其它GAG的细胞系仍容易被黄病毒感染,说明黄病毒与GAG的结合并不是病毒进入这些细胞所必需的,但它们的结合仍有助于病毒的聚集,从而促进病毒与宿主细胞表面更特异的受体结合。硫酸乙酰肝素(HS)是一类广泛存在于细胞表面及基质中的高度硫酸化的氨基葡聚糖,表面具有大量负电荷,具有介导病原体吸附等多种生物学功能。研究发现ED3的284-310位和386-411位可能为HS的结合区。HS的硫酸化对E蛋白与受体的结合是必需的,如用含硫酸化抑制剂的培养基培养Vero细胞,细胞存活并不受影响,但在很大程度上抑制了其与E蛋白的结合。但Martinez-Barragan等发现,Vero细胞上另一种糖蛋白也与DENV的吸附相关,并且不受HS影响,提示还有其他高亲和的受体存在,病毒与受体的结合并非单一分子,且不同细胞发挥受体作用的分子也不尽相同。近年来,运用VOPBA和质谱等技术陆续发现了一些DENV易感细胞上与DENV吸附有关的蛋白质分子,推测为DENV的受体分子,如白纹伊蚊细胞上的40kDa、45kDa、67kDa、80kDa蛋白质,人巨噬细胞上的HSP70/HSP90等。最近,Kuadkitkan等利用2D-VOPBA和质谱技术在DENV2感染的C6/36细胞上发现了抗增殖蛋白(prohibitin,PHB)受体,PHB基因是一种有效的肿瘤抑制基因,广泛分布于不同种属的各种生物细胞中,对细胞代谢、生长、分化、衰老以及凋亡等诸多方面发挥着重要的调控作用。通过抗体感染抑制实验发现,PHB的单克隆抗体可抑制DENV对C6/36细胞的感染,推测是PHB的单克隆抗体封闭了PHB受体,从而抑制了病毒的吸附;进一步的CO-IP实验表明,PHB可与DENV2E蛋白发生特异性的结合,证实了PHB为DENV2在C6/36细胞上特异性受体。运用同样的方法,Jindadamrongwech等在DENV2感染的HepG2细胞上发现了90kDa的葡萄糖调节蛋白78[glucoseregulatedprotein78,GRP78(Bip)],它是一种内质网伴侣蛋白,能在多种细胞表面表达,可结合DENV2ED3介导病毒的入侵;Thepparit等在相同的细胞上发现了37/67kDa的层黏连蛋白受体,37kDa是蛋白前体,二聚体酰化为67kDa的成熟蛋白受体,它作为一种非整联蛋白性质的蛋白受体分子,介导细胞与层黏连蛋白的相互作用,运用该受体的单克隆抗体或重组表达的蛋白质处理的HepG2细胞可抑制DENV1的感染,证实其为DENV1的特异性受体。3.denv1与质膜融合的机制病毒的感染过程包括病毒的吸附-穿入-脱壳-基因组复制-病毒颗粒的组装和释放。登革病毒与细胞表面受体结合后,必须完成病毒包膜与宿主细胞膜的融合过程,才能将核衣壳释放到细胞质中,启动病毒的复制与增殖过程。不同于其它通过融合蛋白与细胞受体或共受体结合引发的病毒融合过程,登革病毒的膜融合过程是由E蛋白介导的病毒被内吞到内含体中,由内吞体中的酸性pH条件所触发的病毒包膜与细胞质膜的融合过程。包膜ED3在介导病毒与宿主受体的融合中具有重要的功能。在中性和微碱性的条件下,成熟病毒体表面的E蛋白以反向平行构成的同源二聚体的形式存在,ED2的融合肽被ED1的糖侧链所封闭。病毒感染宿主细胞,包膜ED3蛋白与宿主细胞表面特异性受体结合,发生受体介导的内吞作用,病毒进入细胞的内含体,酸性的内含体环境触发E蛋白结构发生重排,由二聚体解聚重排成呈发卡结构的三聚体,ED3从E蛋白的末端回折深入到ED1与ED2形成的狭缝处,ED2暴露出疏水的融合肽,并以融合肽插入质膜的方式将E蛋白锚定于质膜上,这种变构传递给病毒包膜结合宿主细胞膜时所需的能量。然后,E蛋白自身回折拉近与其N端融合肽相连的质膜和与跨膜区相连的病毒包膜的距离,最终完成膜的融合(图3)。Nayak等在对DENV1与质膜融合过程的研究中发现,其E蛋白结构域ED1和结构域ED3之间的界面上存在一个由4个极性氨基酸残基组成的束状结构,其中两个残基His-282和His-317是DENV1所独有的,能在内含体低pH条件下触发E蛋白构象改变。其中,His-317是关键部分,可在低pH时破坏结构域ED1和结构域ED3之间的界面并加固融合后E蛋白三聚体在对内含体pH降低时作出反应,触发融合构象的改变。结构域ED1和结构域ED3之间的界面出现的这种极化束状结构说明,DENV1E蛋白三聚体比DENV2E蛋白三聚体更加稳固,也就是说如果要使DENV1发生融合,需要更低的pH值。4.fgloop基因病毒的毒力是指病毒的侵袭力和诱发细胞病变引起炎症的能力,其影响因素很多,凡能影响病毒生活周期的因素均可影响病毒的毒力。有研究者通过感染性cDNA克隆定点突变、中和逃逸突变株和由感染性cDNA克隆构建的病毒嵌合体等方法,确定了E蛋白上不同的病毒毒力决定簇,并按区域进行了划分,如连接ED1和ED2区的极性铰链区、prM与E蛋白的交界处、融合肽、E蛋白的糖基化位点和ED3区等。由于包膜ED3主要参与病毒与细胞受体的结合,它的改变将影响病毒对靶细胞的识别,因此作为一个重要的毒力决定簇而引起人们关注。登革病毒包膜ED3区外侧F和Gβ-片层之间有个环状结构,称FGloop,它含有保守的Arg-GlyAsp(RGD)模体,是公认的结合素类受体,如纤连蛋白III型受体,它的突变将影响病毒与细胞表面糖胺聚糖类分子的结合,导致E蛋白发生错误折叠,未折叠的E蛋白停留在内质网内,延迟病毒颗粒的组装,从而降低了病毒滴度,减弱了病毒的侵袭力。Erb等利用DENV2感染性cDNA克隆定点突变的方法,研究了FGloopAAS381-386序列突变、缺失株对C6/36、Vero、HepG2细胞及伊蚊的感染影响,结果发现FGloopAAS381-386序列突变、缺失株仍可在C6/36细胞中进行感染和稳定复制,而在伊蚊和哺乳动物细胞中只能进行初步感染,复制的子代病毒序列会发生突变,不能稳定复制,也就是说FGloop是登革病毒在伊蚊和哺乳动物细胞中增殖所必需的,进一步的抗体阻断实验发现,运用特异性3H5单克隆抗体阻断FGloop位点后,登革病毒感染细胞的能力下降,证实FGloop是登革病毒抗体特异的结合位点,它的突变将大大影响病毒对其敏感细胞的毒性。在对