高效液相色谱-质谱hplc-msms检测猪肉中6种大环内酯类抗生素残留的研究

高效液相色谱-质谱hplc-msms检测猪肉中6种大环内酯类抗生素残留的研究

大环内酯类抗生素（malas）对革兰氏阳性细菌、阴性细菌和腺体的抗菌作用非常好，临床应用广泛。在预防性药物中，该药物通常被用作饲料添加剂，但会残余在动物食品中的药物，可能会引起毒性反应并容易引起细菌耐药性。欧美许多国家已经禁止在食品动物生产中添加抗生素,我国也已制定了本类药物的最高残留限量。因此,建立快速、可靠的方法来分析监测这类药物在动物性食品中的残留具有重要意义。大环内酯类药物传统上采用微生物测定,特异性不强,准确性差。近年来有用高效液相色谱检测的报道,但有些药物,如红霉素等没有紫外吸收,难以用高效液相紫外检测,液相色谱串联质谱是比较理想的选择。本文采用乙腈提取样品,C18小柱净化后采用LC-ESI-MS/MS分析测定猪肉中的6种大环内酯类抗生素。1实验部分1.1标准贮备液及标准工作液替米考星(90.3%)、红霉素(885U/mg)、泰乐菌素(950U/mg)、吉他霉素(1462U/mg)、罗红菌素(97%)及交沙霉素(98.0%)对照品由中国药品生物制品检定所购入,用甲醇溶解各种药物的对照品制成浓度为1.0mg/mL的标准贮备液,贮存于-20℃冰箱中。使用时配成不同浓度的中间混合标准溶液及标准工作液。甲醇、乙腈、甲酸、正己烷等均为色谱纯或分析纯;水为超纯水;C18固相萃取小柱;猪肉从农贸市场购买。SymmetryC18不锈钢色谱柱(150mm×2.1mm,3.5μm,美国Waters公司)。液质联用仪由Agilent1100液相系统和API4000三重四极杆质谱串联组成,氮气吹干仪等。1.2柱温b.进样量35液相条件:流动相:0.2%甲酸水溶液(A)+0.2%甲酸乙腈溶液(B);流速:0.25mL/min;梯度0～7min10%～50%B,7～7.1min50～10%B,7.1～13min10%B;柱温:30℃;进样量:5μL。质谱条件:电喷雾离子源(ESI),正离子扫描,多反应监测(MRM),电喷雾电压(IS)5500V,雾化气压力(GS1)0.28MPa,辅助气流速(GS2)40L/min,气帘气压力(CUR)0.14MPa,离子源温度(TEM)650℃,碰撞室压力(CAD)48kPa。1.3离心条件的提取称取5g(±0.05g)均匀试样置于50mL聚丙烯离心管中,加入13mL乙腈,10000r/min匀浆30s,超声5min,4500r/min离心3min,上清液移入25mL比色管,用10mL乙腈重复提取残渣,合并上清液,用乙腈定容至25mL。取5mL提取液,40℃下氮气吹至近2.5mL,加入7.5mL水,5mL正己烷旋涡混匀后离心。下层液体进一步用乙腈活化的C18小柱净化,用5mL水洗涤,4%的氨甲醇6mL洗脱,收集洗脱液,40℃下氮气吹干,残渣用1mLV(乙腈):V(水)=50:50溶解,过0.22μm的滤膜上机检测。1.4标准曲线将6种药物的混合标准贮备液用甲醇依次稀释成10、50、100、200、500、1000μg/L的质量浓度,制作标准曲线。1.5加标回收率试验添加质量浓度为2.5、5、10μg/mL的混合标准工作液0.1mL,制得50、100、200μg/kg添加水平样品,按上述方法处理,测定本方法的回收率。2结果与讨论2.1定性和定量分析用1.0μg/mL的单个标准溶液直接注入质谱仪获得各药物的一级质谱图,选择各药物的[M+H]+峰作为母离子,进行二级电离,以MRM模式进行定性和定量分析(见表1)。典型多反应监测空白添加及猪肉样品色谱图如图1所示。2.2．形拖尾、响应值在流动相中添加0.2%的甲酸,能有效解决峰形拖尾,且响应值增大。当进样量或者有机相的初始比例过大,各种药物在2min左右出峰,部分药物先被洗脱,所以控制进样量为5μL。2.3乙腈提取液中脂肪的测定正己烷的脱脂效果比异辛烷好,可以有效去除乙腈提取液中的脂肪。比较C18及HLB柱固相萃取效果,两者回收率差别不大,但HLB柱的成本比较高,故本实验选择C18柱。2.4检测限和检测限在10～1000μg/L的范围内,6种药物的线性良好,相关系数R均大于0.998。以3倍信噪比计算检测限,替米考星和吉他霉素的检出限为0.1μg/kg,红霉素、泰乐菌素、罗红霉素和交沙霉素的检测限为0.05μg/kg。6种药物在50、100及200μg/kg3个添加水平上,回收率均在62.2%～102%之间,相对标准偏差在2.7%～16%之间。3方式1:13min内苯磺酸钠分离,作用