细胞周期素依赖激酶抑制剂olomoucine对脊髓损伤后轴突再生微环境的影响

细胞周期素依赖激酶抑制剂olomoucine对脊髓损伤后轴突再生微环境的影响

骨髓损伤（rc）后，胶体细胞过度激活，形成胶体瘢痕。致密的胶质瘢痕以及其分泌的以硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)为主的大量抑制因子,严重阻碍了轴突再生。改善中枢神经系统(CNS)损伤后的微环境可能有利于轴突的再生从而促进脊髓损伤后结构和功能的恢复。我们的前期研究已经表明,给予细胞周期素依赖性蛋白激酶(CDK)抑制剂olomoucine调控细胞周期,可有效抑制星形胶质细胞的有丝分裂,从而抑制其过度活化、增殖。本研究采用免疫荧光技术和免疫印迹等方法,观察olomoucine对实验大鼠SCI后细胞周期素(cyclin)A、cyclinB1、cyclinE和增殖细胞核抗原(PCNA)等细胞周期相关蛋白的表达、胶质瘢痕形成、CSPG的分泌以及对轴突再生的标志物之一生长相关蛋白43(GAP-43)表达的影响,从而探讨其对损伤后轴突再生微环境的影响及意义。小鼠单克隆抗体pahs的制备1.动物分组及模型制备:健康SD大鼠45只,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供,雌雄不限,体重200～250g。随机分为假手术组、损伤对照组和olomoucine干预组,每组各15只。脊髓半切损伤模型制备参照Tuszynski等的方法,6%水合氯醛(0.5ml/100g)腹腔注射麻醉后,以T10棘突为中心,暴露5mm长的脊髓节段,假手术组到此即可止血缝合。损伤对照组和olomoucine干预组则用眼科手术剪纵向剪开硬脊膜,以尖刀片紧贴脊髓后正中动脉左侧(避免损伤后正中血管),垂直刺入脊髓腹侧达骨质后划向左侧,距吻侧切口3mm处重复1次切割,在两者间用显微手术剪将左侧半完全离断,并尽量取出脊髓。无创缝线缝合硬脊膜,将明胶海绵贴于表面彻底止血,逐层缝合肌肉和皮肤。术后给予抗生素,必要时补液。每日膀胱按摩2次至其排尿反射恢复为止。损伤干预组在脊髓损伤后30min、24h时分别腹腔注射olomoucine[美国Sigma公司,4mg/kg,用二甲基亚砜(DMSO)溶解后双蒸水稀释至DMSO终浓度为2%];损伤对照组和假手术组在相应时间点腹腔注射等量的DMSO稀释液。2.标本取材和准备:各实验组大鼠(每组5只)于术后4周时在麻醉状态下,4%多聚甲醛溶液灌注固定,取以伤段为中心长约15mm的损伤脊髓节段置于4%多聚甲醛溶液中固定6h,30%蔗糖溶液中4℃沉底。冰冻切片包埋剂包裹,异戊烷中骤冻后置于-70℃冰箱保存。取出待切组织于-20℃恒冷箱切片机中连续切片,片厚10μm。3.Western印迹:各组大鼠(每组5只)于术后3d时快速剥取损伤节段脊髓组织,加入裂解液冰上孵育并彻底匀浆、离心后留取上清,考马斯亮蓝G-250法测定蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白;全湿式电转法转移到聚偏二氟乙烯膜上;5%脱脂奶粉封闭2h后分别加入相应的一抗(包括兔抗cyclinA、cyclinB1和cyclinE抗体,美国Neomarkers公司,稀释度均为1∶100);小鼠单克隆抗增殖细胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)抗体,北京中山公司,稀释度1∶200;内参为兔抗肌动蛋白,武汉博士德公司,稀释度1∶300)4℃孵育过夜。用TBST溶液(含0.05%吐温-20的TBS)洗涤10min×3次;加入相对应的二抗(HRP标记羊抗兔IgG和HRP标记羊抗小鼠IgG,稀释度均为1∶300,北京中山公司),37℃孵育90min;TBST洗膜10min×3次,DAB系统显色,双蒸水终止反应。凝胶成像分析系统摄像并进行分析,结果以目的条带灰度值与同一样本肌动蛋白灰度值的比率来表示。4.免疫荧光染色:冰冻切片经固定后,用10%牛血清白蛋白封闭2h,滴加胶质纤维酸性蛋白(GFAP)兔抗大鼠多克隆抗体(北京中山公司,1∶100)和CSPG小鼠单克隆抗体(美国Sigma公司,1∶500)以及兔抗大鼠GAP-43抗体(美国Chemicon公司,1∶500)后置于湿盒内4℃孵育过夜。PBS洗后,分别滴加相对应的二抗(FITC标记的羊抗兔IgG,北京中山公司,1∶100;CY3标记的驴抗鼠IgG,美国JacksonImmunoReseach公司,1∶100),室温避光孵育40min后流水冲洗,50%甘油封片,荧光显微镜下观察结果。采用OLYMPUSMicroImage4.0图像处理系统进行图像分析。5.后肢运动功能评估:分别于术后1d、1、2、4、6、8周采用改良Gale联合评分法(CBS),对动物瘫痪后肢进行运动功能评估,包括开放空间中运动能力、脚趾伸展能力、触地反应、回缩反射、矫正反射、斜板试验、游泳试验等7项评定。正常为0分,全瘫为100分。6.统计学处理:计量资料以x±s表示,运用SPSS11.0统计软件包对数据进行处理,组间比较采用单因素方差分析。星形胶质细胞增殖1.Western印迹分析:假手术组3d时cyclinA、cyclinB1、cyclinE和PCNA表达微弱,脊髓损伤后表达明显增强(P<0.01),给予olomoucine干预可显著下调cyclinA、cyclinB1、cyclinE和PCNA的表达(P<0.05)(图1)。2.免疫荧光染色:假手术组星形胶质细胞形态纤细,数目较少,GFAP、CSPG以及GAP-43的表达较弱;SCI后损伤区域星形胶质细胞明显活化增生,表现为胞体肥大,突起增多增粗,GFAP表达增强,细胞密度增加,并可见粗大的胶质瘢痕形成,在损伤区CSPG免疫反应性也明显增强(P<0.05),并与GFAP的表达部分重叠,损伤区域GAP-43表达也有所增强;olomoucine干预后GFAP和CSPG表达明显减弱,胶质细胞增生显著受抑,未见明显的胶质瘢痕形成,GAP-43的表达较损伤对照组也明显增加(P<0.05)(图2,3)。3.运动功能评估:损伤对照组与olomoucine干预组大鼠术后损伤同侧后肢明显瘫痪,但前2周两组大鼠后肢功能评分差异无统计学意义,2周后各时段差异有统计学意义(P<0.05),olomoucine干预组运动功能评估明显优于损伤组(图4)。cspg的调节作用成年哺乳动物CNS损伤后轴突往往不能有效再生,而造成不可逆性的神经功能缺损。影响CNS有效修复的原因相当复杂,主要归结于以下两方面的作用:一是CNS神经元本身缺乏有效的再生能力,二是它们的再生被抑制性的CNS微环境所抑制。后者可能起着更为重要的作用。其中以星形胶质细胞为主要成分的胶质瘢痕,以及其产生的包括CSPG在内的一些抑制性因子,是影响SCI后轴突再生的关键因素之一。如何有效地控制SCI后胶质细胞过度增殖及其产生的抑制因子、改善损伤后CNS微环境从而促进轴突再生是目前研究者们关注的焦点。CSPG是一组共价结合硫酸葡聚糖链的细胞外基质蛋白质,在受损的CNS中主要是由活化增生的星形细胞产生,也可由少突胶质细胞前体细胞和脑脊膜细胞产生。曾有研究发现,将周围神经组织植入大鼠脊髓的损伤区域后能够再生,但再生的轴突到达CSPG丰富的损伤区后就停滞不前,表明CSPG对SCI损伤后的轴突再生有明显的抑制作用。Bradbury等用软骨素酶降解损伤脊髓内的CSPG,能明显促进感觉与运动轴突的再生,并恢复一定的功能。我们的前期工作提示,胶质细胞具有活跃的细胞周期,在缺血或损伤刺激下,部分胶质细胞快速进入细胞周期,进行有丝分裂,最终使其数目增加。我们在星形胶质细胞体外划痕损伤模型中和脑梗死模型中,曾给予CDK抑制剂olomoucine进行了干预,发现它可以显著抑制损伤后胶质细胞的过度活化和增殖。我们希望通过对细胞周期的调控,来抑制SCI后胶质细胞的增殖和胶质瘢痕的形成、减少相关抑制性因子的产生,从而有效改善脊髓损伤后轴突再生微环境,促进肢体功能的恢复。olomoucine是一种嘌呤衍生物,主要是通过竞争性抑制CDK的ATP结合位点抑制CDK1、CDK2及CDK5等酶的活性,从而抑制cyclinB/CDK1、cyclinE/CDK2、cyclinA/CDK2等复合物和ERK1/MAP激酶的活性。这些复合物、激酶能与其底物发生作用,推动细胞周期继续进展、启动DNA复制和有丝分裂。抑制CDK则使细胞周期停滞于G1/S和G2/M转折点,细胞DNA合成和细胞分裂受到阻滞,从而达到抑制细胞分裂增殖的目的。PCNA是反映细胞增殖的敏感指标,cyclinA、cyclinB1、cyclinE则是细胞周期中的G1/S和G2/M转折点的重要的细胞周期素,促进细胞的增殖和分裂。本研究中的Western印迹结果显示,olomoucine干预可以明显下调脊髓损伤组cyclinA、cyclinB1、cyclinE和PCNA的高表达,从而有效抑制细胞的增殖。我们的免疫荧光结果发现,脊髓损伤后CSPG在胶质瘢痕中的表达明显增多,大部分与GFAP的表达重叠,直接提示CSPG可能大部分由星形胶质细胞合成分泌,并为神经元轴突再生的重要抑制因子。给予olomoucine干预后可以明显减弱星形胶质细胞活化和增殖,抑制胶质瘢痕形成,有效下调GFAP和CSPG的表达。GAP-43是神经元轴突生长发育和可塑性的分子标记物,SCI后GAP-43的表达上调,表明其可能参与了损伤后的生长修复过程。正常的成熟CNS中GAP-43较微弱,而给