大鼠脑中硫贲妥钠麻醉的神经机制研究

大鼠脑中硫贲妥钠麻醉的神经机制研究

1材料和方法1.1抗、小鼠血清硫醇钠（sp）是上海的一种新亚药物公司。Ⅰ抗为兔抗FosIgG(1∶500),北京中山生物有限公司产品。Ⅱ抗为生物素化抗兔IgG(1∶500),Vector试剂。生物素-亲合素-辣根过氧化物酶复合物ABC液(1∶500),Sigma公司产品。小牛血清为武汉生物化学试剂厂产品。Olympus荧光显微镜为日本产品。Sprague-Dawley大鼠由第四军医大学动物中心提供。1.2动物的饲养及饲养SD大鼠24只,♀♂不拘,随机分为空白对照组、硫贲妥钠静脉麻醉15、20和25mg·kg-14组。实验前将大鼠放置在室温为20℃的安静环境中饲养24h以上,以消除强光、噪音等额外刺激。实验时分别将对照组动物注射等量的生理盐水和不同剂量的硫贲妥钠麻醉1h。1.3全脑d-pcr法各吸入麻醉组动物和对照组动物在戊巴比妥钠麻醉下立即用手术器械开胸,右心房开窗,经升主动脉灌注4%多聚甲醛(0.1mol·L-1,PB,pH7.4)500ml,90min后取全脑置于20%庶糖液中过夜,连续冠状冷冻切片,片厚50μm,隔5取1,用0.01mol·L-1PBS漂洗3次,入含0.3%Triton的PBS液中30min,以除去内源性过氧化物酶的活性,然后依次入Ⅰ抗,Ⅱ抗和ABC液,最后用硫酸镍胺葡萄糖氧化酶法作呈色反应,各步骤间均用0.01mol·L-1PBS冲洗3次,裱片,晾干后经上行梯度酒精脱水,二甲苯透明,DPX封片。2免疫阳性核酸标记双侧对称分布各组脑切片用Olympus显微镜观察,发现Fos免疫阳性细胞核标记均呈双侧对称性分布,无侧偏现象。其核团内Fos阳性神经元的数量以每单位视野(10×20)内的数目来表示,结果用t检验进行统计学处理。2.1对照组空白对照组在丘脑室旁核(PV),外侧隔核(LS)和外侧缰核(LHb)有少量的Fos阳性神经元,可能与非特异性刺激有关。2.2梨状演变核团的结构硫贲妥钠麻醉1h后,Fos阳性神经元细胞核呈棕黑色,着色有深、中等和浅3个不同层次,胞浆不着色,大多分布在梨状皮层(Pir),伏核(ACB),杏仁基底外侧核(BL)、外侧隔核(LS)、外侧僵核(LHb)、下丘脑室旁核(Pe)、丘脑室旁核(PV)、膝状体腹下核(VLG)、背外侧膝状核(DEn),视上核(SO),视交叉上核(SCh)、视前腹侧核(AVPO)海马回嗅觉小岛(ICj),弧束核(Sol)和乳头状核(SuM)15个核团。2.3cns中fos蛋白表达的数量由表1显示随硫贲妥钠麻醉浓度从15mg·kg-1～25mg·kg-1,CNS中参与麻醉作用的核团中c-fos表达呈逐渐增多的趋势,可佐证CNS中Fos蛋白阳性神经元表达的数量与麻醉深度有关。3头状核和海马回嗅小鼠的功能特性全身麻醉中枢作用部位的研究有近百年的历史,近年来研究表明突触有可能是神经组织结构上全麻作用的位点,但并非是大体解剖上的作用部位。本文应用即刻早期c-fos基因参与神经系统对外界刺激的反应,诱导中枢Fos免疫活性最强的神经元出现在脑内15个神经核团。这些核团内Fos阳性神经元的数量随着硫贲妥钠的用量增加而增多,表明确实参与了麻醉作用的调控过程。本文研究表明Fos阳性核团主要分布在端脑,间脑和脑干,据此可以描绘出一个参与硫贲妥钠麻醉信息传递的中枢通路。目前研究表明杏仁核、伏核、外侧隔核、终纹状核、视交叉上核、缰核,弧束核、乳头状核和海马回嗅觉小岛与中枢其它核团有着广范的纤维联系,主要与情感、睡眠和内脏活动有关。有研究表明刺激杏仁核簇随刺激的位置和强度不同可引起不同的反应结果,其主要表现是:①“遏止反应”,刺激杏仁核簇后自动进行的动作停止;②引起内脏和植物神经反应,如呼吸频率、节律和幅度的改变,血压的升高或降低,心率的增减;③情绪反应,如不安、发怒或安静;④尚可引起内分泌的改变,这些表现与麻醉过程极为相似。缰核是边缘前脑结构至脑干的重要枢纽,它汇聚了边缘系统许多部位的传出纤维,也发出大量纤维投射到脑干的广泛区域,凡与缰核有直接纤维联系的许多结构都参与心血管活动的调节。国内有学者报道在缰核内注射微量利多卡因对电刺激杏仁核内侧能引起升压反应,这种效应可能是通过激活α受体,最终导致交感神经活动增强的结果,此外该核在痛觉调控过程中也起重要作用。膝状体腹下核和背外侧膝状核与听力有关。下丘脑室旁核,丘脑室旁核和视上核与镇痛及内分泌有关。由于各功能核团之间的相互联系和调控方式非常复杂,尚待进一步研究。硫贲妥钠麻醉在中枢神经系统(CNS)的作用部位至今仍不清楚。近年来人们发现了即刻早期cfos基因,在外来刺激条件下,通过第二信使引起神经元c-fos的表达增强,形成fosmRNA。由mRNA翻译成的Fos蛋白立即转位至细胞核内,被认为神经元的第三信使。它参与重要脑功能活动的信号转导和调控过程,是一种脑功能活动形态学定位标记物。已广泛被用于痛觉定位和神经科学中枢通路的研究。该方法是利用神经元受到某种刺激(麻醉也是一种外来刺激)其c-fos基因的表达急剧增加,与此相关结构的神经元