芪贝复元饮对甲减大鼠心肌细胞凋亡及fas,fasl,caspase-3表达的影响

芪贝复元饮对甲减大鼠心肌细胞凋亡及fas,fasl,caspase-3表达的影响

甲状腺功能减退（a级）是指由各种原因引起的组织甲状腺激素合成、分泌或生物效率低下的病理状态。由于多数患者起病隐匿,常造成心、脑及肾脏损害,而心脏是甲减常受累的器官,患者中有70%～80%有心血管系统的病变,主要表现为心动过缓、心包积液、高脂血症和充血性心衰。我们在实验性的甲减大鼠模型中已经检测到心肌细胞凋亡,其凋亡程度与血清T3和T4呈负相关,与TSH呈正相关。细胞凋亡是多种基因复杂变化的结果,其中促凋亡基因Fas、FasL、Caspase-3与之关系密切,故本实验针对甲减Fas、FasL、Caspase-3及心肌细胞凋亡的表达,探讨芪贝复元饮对甲减心肌损害的治疗效果及作用机制。1材料表面1.1实验动物4周龄清洁级健康wistar大鼠120只,体重90～120g,雌雄各半,由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。1.2动物饲料(1)一般饲料均由辽宁中医药大学实验动物中心提供。(2)不同饲料的碘量和饲料的碘量根据卫生部地方病调查以及中国医科大学流行病学结果和承德市地方病研究所提供的资料,采用全国重度缺碘地区河北省承德市隆化县大两间房村的玉米、谷子和黄豆,按照73∶20∶7的比例,加入适量的添加剂(每100g饲料添加CaCO30.5g,Na2HPO40.15g,MnSO450mg,维生素B66mg,维生素B120.05mg,泛酸钙5.5mg,叶酸0.1mg,CoCl24.95μg,宝力维他20mg,酵母粉1g),由沈阳市于洪区前民实验动物饲料加工厂压制成低碘饲料,饲料碘含量为20μg/kg。(3)双蒸馏水,由辽宁中医药大学附属医院临床药品基地提供。1.3血清tsh、tunel、caspase-3试剂(1)中药试剂均由辽宁中医药大学附属医院中药局提供,水煎液均置于4℃下备用。(2)血清TT3、TT4试剂盒由北京赛博润特科技发展中心提供;血清TSH试剂盒购自RapidBio公司;(3)Fas、FasL及Caspase-3多克隆抗体,免疫组化sp试剂盒,DAB显色剂均由北京中杉公司提供。TUNNEL试剂盒购自武汉博士德生物技术公司。(4)乌拉坦、分析纯购自沈阳市试剂二厂。(5)低碘饲料中添加剂:高氯酸钠、CaCO3、Na2HPO4、MnSO4、维生素B6、维生素B12、泛酸钙、叶酸、CoCl2、宝力维他、酵母粉均购自国药集团。1.4超低温冰箱、u3000竞争优势DS–671型电子秤(上海寺冈电子有限公司);电子分析天平;灌胃器(沈阳市实验试剂玻璃仪器厂);VXE380超低温冰箱(法国,Jouan);全自动生化分析仪,(型号:日立7600,美国贝克曼公司);日本光电65ll型心电图机;LG-10低温高速离心机(北京医用离心机厂);生物显微镜(Olympus,Japan);JapanDY89—2型电动玻璃匀浆器(浙江宁波新芝仪器厂);Hw2型恒温水浴箱(南京土壤仪器厂);2方法2.1分组及研究方法将120只大鼠随机分为4组:正常对照组、模型组、芪贝复元饮组、L-T4组,每组30只。正常组饲以普通饲料及双蒸馏水,实验组造模参照Kolaja法,饲以实验专用的低碘饲料,喂1%高氯酸钠19天后停用,续喂双蒸馏水2天(共计21天),给处理因素后仍饲以低碘饲料及双蒸馏水,直至实验结束。2.2按照配方的原则,分为贝复元饮和l-t4组正常组:饲以普通饲料,每日4mL双蒸水分两次等量灌服。模型组:饲低碘饲料,每日4mL双蒸水分两次等量灌服。芪贝复元饮组:太子参、生牡蛎、制鳖甲、夏枯草、黄芪、当归、柴胡等;每只鼠每天灌服含生药量29.9g/kg的芪贝复元饮。L-T4组:低碘饮食,每天灌服2ml含0.52μg/kg左旋甲状腺素钠片的混悬液(根据体重约1-2周增加0.52μg/kg),并灌服等体积的双蒸水。分别在给处理因素后的0、8周处死动物,每组每次相应处死12只动物。2.3样品的采集和保存(1)腹主动脉采血处死前,称体重,腹腔注射20%乌拉坦麻醉,腹主动脉采血5mL,以3000r/min分离10min,血清存1.5mLeppendorf管中,-20℃冰柜中保存。(2)患者心肌组织固定腹主动脉采血后,准确迅速取出心脏,以冷盐水充分灌洗,滤纸拭干并迅速称湿重,后取左室壁中部横断面心肌组织于固定液中固定,用于标本的制作。2.4观察指标(1)检测甲状腺激素和tsh水平放射免疫分析法测定血清TT4、TT3;血清促甲状腺激素(TSH)测定采用ELISA法,RapidBio试剂盒。(2)组织病理学观察迅速准确取出心脏,从大鼠左室心尖部切取1mm×1mm×1mm心肌组织,4%多聚甲醛磷酸缓冲溶液中固定24～48h,常规脱水、浸蜡、包埋、染色、透明和封片,制成5μm厚HE切片,进行光镜观察。(3)透射电子显微镜观察每组均取心尖区心肌,切取约1mm×1mm×1mm大小的组织块,2.5%戊二醛固定,1%锇酸再固定,清洗、脱水、浸透、包埋,50nm超薄切片,醋酸铀15min和枸橼酸铅30min双重电子染色,日立JEM-1200EX型透射电子显微镜观察、照相。(4)心肌细胞凋亡检测常规方法做心肌HE染色,光镜下观察心肌细胞型他。将蜡块做5μm厚连续切片。按Boster公司原位细胞凋亡POD试剂盒的步骤操作检测心肌细胞凋亡。阴性对照不加TUNEL反应物TdT。DAB显色。阳性细胞判定和计数:凋亡细胞细胞核呈棕褐色。每张切片高倍镜下随机选5个视野,由一名专业人员双盲法数l000个滤泡上皮细胞,计数阳性细胞数。(5)中性树胶封片的制备采用SABC免疫组织化学法检测Fas,FasL和Caspase-3的蛋白表达情况,按照试剂盒说明书操作,制成的中性树胶封片在光镜下阅片并摄像。(6)fas,faspase-3蛋白表达水平检测每张切片都在高倍镜(10*40)下观察,随机采集5个不重复视野,录入计算机图像采集与分析系统,由pc机进行图像分析处理,检测Fas,FasL和Caspase-3蛋白阳性细胞数目和平均灰度值。阳性蛋白数目增多时,平均灰度值降低即表达增强。2.5两个以上的样本均数比较数据以均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)来表示,两个样本均数比较用t检验,两个以上样本均数比较用方差分析。P<0.05有统计学意义。数据全部输入Excell工作表中,用SPSS13.0软件做统计学处理。3结果3.1血清甲状腺激素及tsh见表1。3.2心肌细胞排列光镜下观察可见:正常组心肌纤维排列整齐,横纹清晰,胞核明显。模型组心肌细胞横纹结构不清,肌纤维肿胀断裂,部分胞浆溶解消失,有多处液化性坏死。芪贝复元饮组心肌细胞排列较整齐,胞核清晰,肿胀明显减轻。L-T4组肌纤维肿胀减轻,液化坏死较模型组有减少,见插页XIII图1。3.3各组细胞组织结构透射电镜下可见:正常组肌纤维排列整齐,Z线、M线清楚,相邻肌纤维间有大量线粒体,呈椭圆形,膜完整,嵴清晰。模型组整个细胞水肿严重,线粒体部分或大部分嵴与膜融合或消失,肌节排列紊乱-肌纤维消失。芪贝复元饮组肌节排列较规整,Z线、M线清楚,少量线粒体嵴与膜融合破损。L-T4组肌节排列不整齐,心肌细胞水肿,线粒体多嵴减少,外肤破损并膨出,见插页XIII图2。3.4凋亡细胞的检测TUNEL法检测心肌细胞凋亡,棕褐色或棕黄色细胞核为凋亡细胞,细胞核蓝染为非凋亡细胞,阴性对照无棕色着色。与正常组比较,模型组与治疗各组均出现大量的凋亡细胞(P<0.05);经治疗后,芪贝复元饮组较模型组及L-T4组心肌细胞凋亡指数明显减少,差异有统计学意义(P<0.05),见插页ⅩⅢ图3,表2。3.5各组细胞的表达水平比较光镜下,Fas、FasL及Caspase-3的蛋白免疫阳性细胞胞浆呈棕黄色,散在分布。与正常组比较各组的阳性细胞表达明显增多(P<0.05);芪贝复元饮组与L-T4组相比,阳性细胞表达显著减少,具有统计学差异(P<0.05),见表3。4fas、facl和caspase-3对大鼠心肌凋亡的影响甲减引起的心脏损害最早在1918年由Zondez报道,目前认为甲减病人中有70%～80%有心血管病变,临床表现为心动过缓、心音低钝甚或心包积液、高脂血症和充血性心衰,甲减致心肌损伤和心功能不全的机制复杂,但血清中过低的甲状腺激素水平会导致心肌细胞凋亡。细胞凋亡是在基因控制下不同于细胞坏死的程序性细胞的死亡过程,在调控凋亡的相关基因中,对Fas、FasL和Caspase-3基因的研究越来越多,Fas蛋白为I型膜蛋白,FasL为II型受体型配体,Fas与FasL结合后,引起细胞内Ca+浓度升高,从而活化Caspase,引起细胞凋亡。祖国医学将甲减归为“虚劳”的范畴,一般认为本病主要病机为本虚,病位主要在肾,涉及心、脾。实验研究主要集中在温肾助阳药上。临床研究发现脾气虚弱也是甲减的主要证型,因此,通过补气固本来抑制心肌凋亡也是中医研究治疗甲减的焦点之一。芪贝复元饮是由黄芪、太子参、生牡蛎、制鳖甲、当归、柴胡等药物组成,方中黄芪、太子参,归脾、肺经,补中益气,升阳固表;生牡蛎、制鳖甲潜阳补阴,软坚散结;当归、柴胡补血活血,诸药合用,共奏补气固本之功效。心肌细胞形态学及超微结构的改变是反应细胞损害最直观的指标,本实验光镜和电镜下观察可见模型组大鼠的心肌纤维肿胀断裂,线粒体部分或大部分嵴与膜融合或消失,肌节排列紊乱-肌纤维消失;模型组大鼠不仅心肌细胞凋亡率升高,Fas、FasL和Caspase-3的阳性表达也明显上调,表明甲减状态下可诱导F