基于家系的家系wdr-aq-fop多态性与侵袭性牙周炎的关联研究

基于家系的家系wdr-aq-fop多态性与侵袭性牙周炎的关联研究

所谓牙周炎，是一种与慢性牙周炎显著不同的牙周炎。临床表现为早牙、早牙、早叶牙，具有一定的家族聚集能力。病因包括复杂的外源因素(微生物因素与环境因素等)和遗传因素。流行病学研究显示,人群中不同个体的易感性有很大差异,这种差异可能主要是由遗传因素决定的。目前已发现人类多个基因序列的多态性同牙周炎的易感性和牙周组织破坏程度相关,其中维生素D受体(vitaminDreceptor,VDR)是1,25(OH)2D3发挥生物学效应的核内生物大分子,其本质是一种调控细胞内基因表达的转录因子。VDR广泛分布于体内各组织细胞中,参与骨代谢和免疫炎症反应。一些研究表明,1,25(OH)2D3及其受体VDR的基因多态性不仅与骨关节疾病有关,而且与牙周炎关系密切。学者们发现,与骨代谢有关的VDR基因多态性位点有4个,分别为BsmⅠ、ApaⅠ、TaqⅠ、FokⅠ。近年来,国内外学者对这些位点的多态性与牙周炎易感性的关系进行了研究,但结果不一,可能与样本量、疾病表型定义、种族差异、环境暴露以及人群分层等因素有关。家系研究可以较好地避免人群分层等因素的影响,被用于多因素疾病的研究中。本课题组以往的研究结果表明,VDRTaqⅠ和FokⅠ位点的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms,SNP)可能与中国AgP患者的易感性有关,但这种关联性有待于在家系人群中得到证实。本研究拟用家系研究的方法对AgP患者及其亲属VDRTaqⅠ和FokⅠ位点的多态性与AgP的易感性进行关联分析。1数据和方法1.1agp的诊断以2001年7月至2009年6月间在北京大学口腔医院牙周科门诊确诊的93例AgP先证者及先证者引荐法(probandinitiatedenrollment)纳入的155例一级亲属作为研究对象。本研究已通过北京大学生物医学伦理委员会的批准,所有研究对象均签署知情同意书。AgP的确诊参照1999年国际牙周病分类研讨会所制定的标准,纳入条件包括:年龄小于36岁;快速的牙槽骨破坏和附着丧失;全口至少有2颗牙(其中一颗为第一磨牙)的探诊深度≥5mm,邻面附着丧失≥3mm,每名患者均拍摄全口根尖片证实有邻面牙槽骨吸收;患者除患牙周炎外,全身健康,无糖尿病、心血管疾病和血液疾病等系统性疾病,女性未怀孕或哺乳。亲属的诊断参照1999年牙周病分类法和现状与回顾性相结合(thecurrentandretrospectivediagnosisandreportedcasehistory)的评分标准对其牙周破坏状况作出评估诊断,即利用现有临床证据(包括全口根尖片、全口牙周检查大表),并结合其口腔既往诊疗记录或牙周疾病史对是否患有AgP的可能性进行评分后做出评估。根据其可以诊断为AgP可靠程度的不同,定义为确定、较确定和可能3种诊断类型。由于可能型患者患病的证据相对较少,故在本研究中将可能型患者归为非AgP。1.2引物和病毒的合成小量外周血基因组DNA提取试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)、PCR反应相关试剂(包括TaqDNA聚合酶、dNTP、10×PCRbuffer、2000bpDNAmarker,均来自TaKaRa宝生物工程有限公司)、限制性内切酶(TaKaRa宝生物工程有限公司)。用于扩增VDR基因的引物由北京奥科生物技术有限公司合成,TaqⅠ序列为:Fw5′CAGAGCATGGACAGGGAGCAAG3′,Rv5′GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTC3′;FokⅠ序列为:Fw5′AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGGCTCT3′,Rv5′ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC3′。1.3方法1.3.1保存管理表1图4采取外周静脉血1mL,加入含EDTA的抗凝管中,4℃保存。采用上述DNA提取试剂盒提取外周血总基因组DNA,测定浓度和纯度,D260nm/D280nm在1.8～2.0之间,-20℃保存。1.3.2热反应taq和f滨水重性小体制备聚合式总反应体系25μL,其中含模板DNA2ng,引物各10nmol,TaqDNA聚合酶1u,dNTPs各5nmol及相应PCR缓冲液,无菌去离子水补足总体积。TaqⅠ反应条件为:95℃预变性10min后,进行35次循环,循环条件为:95℃变性30s,65℃复性30s,72℃延伸60s;最后72℃延伸7min,扩增得745bp的产物。FokⅠ反应条件为:95℃预变性10min后,进行35次循环,循环条件为:95℃变性30s,65℃复性30s,72℃延伸60s;最后72℃延伸7min扩增得267bp的产物。1.3.3fol制备酶切后fk酶切总体系10μL,其中PCR扩增产物4μL,相应Buffer1μL,0.1%BSA1μL,内切酶5u,加无菌去离子水补足总体积,于37℃水浴消化1h。FokⅠ酶切后,等位基因f显示61bp、206bp2个片段,等位基因F无酶切位点,仍为267bp。TaqⅠ酶切后,等位基因t显示290、245和205bp3个片段,等位基因T显示495和245bp2个片段。1.3.4凝胶成像分析酶切产物10μL,琼脂糖凝胶电泳,凝胶含溴化乙锭(ethidiumbromide,EB)替代物GoldViewTM,凝胶成像分析系统观察结果并分析基因型。分型标准:FF型为267bp1个片段,Ff型为267、206、61bp3个片段,ff型为206、61bp2个片段;TT型为495、245bp2个片段,Tt型为290、245、205和495bp4个片段,tt型为290、245和205bp3个片段。1.4系为基础的关联检验计量资料用均数±标准差表示,计数资料用百分比表示,分别采用t检验和χ2检验对这些资料进行各诊断组分布差异的比较。基因多态性与AgP临床表型的关联采用以家系为基础的关联检验(familybasedassociationtest,FBAT)的方法。应用的统计学软件是SAS8.0。FBAT方法是以核心家系为单位计算每个核心家系数的基因型的分布概率和统计量“S”(统计量S为表型T与基因型X的乘积),然后累加各核心家系的统计量S及S的方差与协方差,进行卡方检验,该方法适用于家系资料不完全及一些亲代表型资料缺失的情况,需要用一定的遗传模型描述遗传表型中基因的效应,本研究分别采用显性、隐性、加性遗传模型进行检验。2重复实验的结果样品提取、PCR扩增和酶切均获成功,随机抽取10%的样本(共25个)进行重复实验,结果显示100%相同。基因型测定的典型电泳结果见图1、2。2.1核心家系研究领域155例血缘亲属中的成员组成为:父亲61例,母亲51例,同胞43例,属于核心家系研究。研究对象的基本资料如表1所示,先证者及其亲属的性别比均为女性偏高,先证者中男女性别比为1∶1.91(32/61),同胞中男女比例1∶1.39(18/25)。2.2研究对象的基因型分布研究人群的T和t等位基因频率分别为94.6%和5.4%。未发现tt基因型,93个先证者中Tt基因型共有10人,其中3人父亲为Tt基因型,母亲为TT基因型,因此先证者的t等位基因来自父亲;另外3人父亲为Tt基因型,母亲未知,但母亲是Tt基因型的概率为3.3%(表1),因此t等位基因来自母亲的概率小于或等于3.3%,而来自父亲的概率大于或等于96.7%;其余4人未知。此外,AgP先证者父亲t等位基因频率显著高于母亲,9.8%vs1.6%,χ2=7.742,P=0.005,其余各亲属组以及先证者TaqⅠ等位基因/基因型的分布差异无统计学意义(表1)。研究人群的F和f等位基因频率分别为57.1%和42.9%。FokⅠ等位基因/基因型在各亲属组以及先证者中的分布差异无统计学意义(表1)。2.3隐性3种遗传模型检验未发现VDR基因各位点的多态性与AgP存在具有统计学意义的关联,即VDRTaqⅠ和FokⅠ各等位基因在加性、显性及隐性3种遗传模型的检验中,P值均大于0.05(表2)。将先证者按性别分组后进行VDRFokⅠ位点多态性的FBAT检验,结果在加性、显性及隐性3种遗传模型的检验中,差异亦无统计学意义。当把所有AgP患者按照全口牙槽骨吸收特点进行亚型分型(分为以局限型破坏为主型和广泛型两组)后进行FBAT检验,结果两组均未发现VDRFokⅠ基因多态性与AgP的关联。3vdr基因多态性与agp关联研究本研究中93例先证者的男女性别比为1∶1.91,存在较明显的性别差异,可能与其他研究所报道的因牙齿原因就诊的女性多于男性而导致研究对象选择的偏倚有关,而并非疾病所致。AgP先证者家属的诊断一直是AgP家系研究的难题,本研究对于AgP先证者家庭成员的诊断,借鉴Hodge等现有检查与病史回顾性相结合的评分标准对其牙周破坏状况作出评估诊断。所有先证者都有全口牙周检查记录和X线片的全面诊断,绝大部分亲属也都有X线诊断、全口的牙周检查记录大表,在此基础上结合病史对其进行评分做出评估诊断,最大限度地提高诊断准确性,使对结果的影响降到最低。侵袭性牙周炎作为一种多因素疾病,存在一定的家族聚集性,提示个体的遗传因素是影响宿主反应性的重要因素,所以对于牙周病遗传因素的研究一直被广为关注,而家系研究一直是遗传学家及临床医师公认的识别可疑致病因素及异质性的最好的研究策略。以往的学者通过系谱分析、分离分析以及连锁分析进行了AgP遗传模式的探索和基因定位,结论不一,主要原因是上述方法对于多基因疾病的检测能力有限,并且受家系资料完整程度以及家属诊断的准确程度影响。复杂性疾病是多个微效基因协同作用并与环境因素共同导致的疾病,所以对于复杂性疾病中起微效作用基因的分析现在多倾向于采用效力较高的关联研究。关联研究根据对照组的不同分为群体关联研究和以家系为基础的关联研究。群体关联研究(population-basedassociationstudy)是基于群体中无亲缘关系的病例组和表型正常的对照组在某个遗传标记位点上会出现不同的频率,故也称病例-对照研究(case-control),通过两者频率的差异就能推测所研究的遗传标记和某个遗传病易感位点之间是否存在关联。肯定存在遗传标记与疾病关联的解释可以归纳为两种:一种是遗传标记位点本身就是疾病位点,与多基因遗传病的发生有关;另一种是遗传标记位点与疾病发生无关,但是与致病基因位点存在很强的连锁不平衡(linkagedisequilibrium)。群体关联易受人群分层的影响,产生假阳性结果,以家系为基础的关联研究可以很好的弥补这种不足,排查虚假关联。以往的病例对照研究发现VDR基因多态性可能与AgP有关联,但国内外均没有家系研究的结果对其进行证实,本研究的结果对于VDR基因多态性与AgP关联的研究起到了验证和排查假阳性结果的作用。VDRTaqⅠ位点位于VDR基因的第9号外显子,该位点的多态性改变是C/T改变,不影响氨基酸序列,但研究证实该位点与很多病生理过程有关,例如骨代谢、免疫调节、细胞生长分化凋亡等,因为该位点与VDR基因3′端存在较强的连锁不平衡(linkagedisequilibrium,LD),并且与3′UTR在同一个单倍体域,该单倍体域长17kb,包括4～9外显子和3′UTR。以往国内外学者关于VDRTaqⅠ位点基因多态性与AgP关联的病例对照研究提示t等位基因可能与AgP易感性有关。早在2002年,本课题组孙靖林等关于中国人群的研究纳入了24例成人牙周炎、37例早发性牙周炎和39例牙周健康者,结果发现早发性牙周炎中Tt基因型的检出率显著高于另外两组。而Nibali2008年关于高加索人群的研究则提示吸烟组AgP患者TT基因型显著高于健康对照,而非吸烟组AgP患者与健康对照基因型的分布无显著差异。由于中国人群的t等位基因频率低,因此本研究有遗传信息可以进行FBAT检验的家系较少,只有10家,结果显示TaqⅠ位点的多态性与AgP在3种遗传模型中不存在具有统计学意义的关联,因此,有必要扩大样本,做进一步分析。另外,本研究的结果VDRTaqⅠ位点等位基因t的频率