nadph氧化酶中nox家族的生物信息学分析

nadph氧化酶中nox家族的生物信息学分析

nad-葡萄质酶是由膜亚基ep915（即nox）和p22pho、亚甲基p47pho、p67pho、p40pho和rac组成的酶建筑群。它由53c和其他化合物组成：第1代、第3代、第4代、第5代、第7代和第2代。该家族的蛋白质分布在大多数器官、组织和细胞中。NOX家族蛋白的主要生物学功能是产生ROS,该途径生成的ROS能维持细胞的正常生理活动,但在异常状态下,如机体受到环境中的超细微颗粒物UFPs、生长因子、细胞因子、炎症介质、钙离子(Ca2+),以及重金属镉、铬等刺激时,NOX蛋白过表达产生大量的ROS。研究发现,机体内增加的ROS引起的氧化压力与机体多种疾病,如肿瘤、动脉粥样硬化、高血压、再灌注后狭窄等心血管疾病以及阿尔茨海默病、老年痴呆症等老年性疾病密切相关,所以,NOX家族致病机理的研究在临床疾病的预防、诊断和治疗中有重要的意义。本文对NOX家族的表达、结构、活化模式及其功能做一概述。1nox家族及其亚基的定位和表达1.1nox1基因人类NOX1基因又名MOX1(mitogenicoxidase1,有丝分裂氧化酶1)或NOH1(NADPHoxidasehomologue1,NADPH氧化酶同源物1)基因,位于X染色体q22。NOX1蛋白含有564个氨基酸,是哺乳动物中第一个被确认为gp91phox同源物的氧化酶,与NOX2有60%的同源性。NOX1在结肠上皮细胞内有丰富表达,不仅调节与组织增生和细胞分化相关的信号转导,还参与机体宿主防御;NOX1在血管平滑肌细胞、内皮细胞、破骨细胞、周细胞、肺上皮细胞以及子宫、胎盘、前列腺等细胞和组织中有低水平表达,但前列腺癌和结直肠癌等肿瘤组织及细胞中有高表达。1.2呼吸爆发中nadph氧化酶的催化亚基NOX2是NADPH氧化酶的典型代表,其基因位于X染色体p21.1。NOX2蛋白含有570个氨基酸,是吞噬细胞呼吸爆发时发现的NADPH氧化酶的催化亚基,除在吞噬细胞中有丰富的表达外,在心肌细胞、神经元、骨骼肌细胞、肝细胞、内皮细胞和定向造血干细胞等非吞噬细胞中也有分布;在检测机体各个器官中NOX家族亚型mRNA的组织分布时发现,NOX2在机体内的分布是最广泛的,如卵巢、胎盘、甲状腺、小肠、结肠、脾、胰腺、前列腺和睾丸等组织中均有分布。1.3nox3是内耳的应然氧化酶人类NOX3基因定位于6号染色体q25.1-26,其蛋白含有568个氨基酸,与NOX2有56%的氨基酸序列同源性。最初NOX3被定义为在一些胚胎组织如肝脏和肾脏中表达的酶,但现已证明NOX3是位于内耳的一种NADPH氧化酶,在内耳的耳蜗、前庭的感觉上皮和螺旋神经节内有丰富的表达;胎儿脾脏、胎儿肾脏、头盖骨和大脑等组织中有较低水平的表达。鼠内耳中丰富表达的NOX3是耳石形成必不可少的,可能原理是NOX3产生的ROS调节二酪氨酸与细胞外蛋白发生交联,形成蛋白质沉淀,最终形成耳石的钙化中心。NOX3突变可造成耳石形成障碍,使鼠出现头部倾斜的表型;但NOX3与人类耳石的形成无必然联系,可能与药物如顺铂所致的耳毒性有关。1.4胎和成年肾中nox4mrna的表达人类NOX4基因位于11号染色体q14.2-q21,含有578个氨基酸,与NOX2仅有39%的同源性。NOX4在胚胎和成年肾脏中有较高表达,又被命名为ReNOX。人肾组织NOX4mRNA检测显示,其在髓质集合管和肾乳头上皮细胞高水平表达,在肾单位的远曲小管表达,但在肾小球内的表达水平较低。除了肾脏组织外,NOX4在破骨细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、造血干细胞、成纤维细胞、角蛋白细胞、黑素瘤细胞、神经元以及胰腺、胎盘和胚胎肝组织等细胞和组织内也有表达。1.5nox的表达人类NOX5基因位于15号染色体q22.31,其蛋白由565个氨基酸组成,与NOX2的同源性最低,仅为22%~27%。NOX5有六个剪接变构体,分别为NOX5α、NOX5β、NOX5γ、NOX5δ、NOX5ε或NOX5-S和NOX5ζ。通常说的NOX5实质上是NOX5γ变构体,其有最长的编码序列,因此一般被作为参照序列。NOX5在脾脏、淋巴结和睾丸中有较高水平的表达,在淋巴结内的表达主要集中于T、B淋巴细胞;在血管平滑肌、骨髓、胰腺、胎盘、卵巢、子宫、胃和各种胎儿的生理性组织中有表达。NOX5还在部分肿瘤细胞中有丰富的表达,如卵巢透明细胞癌ES-2细胞、宫颈癌细胞以及巴雷特食管腺癌细胞中均有较高的表达。研究证明,肿瘤细胞中丰富表达的NOX5与肿瘤的进展密切相关。1.6duol蛋白氨基酸序列的变化和来源人类DUOX1和DUOX2亚型基因分别位于15号染色体q21和15号染色体q15.3-q21,其蛋白分别由1551和1548个氨基酸组成。DUOX1和DUOX2蛋白的氨基酸序列有83%的相似性,而DUOX蛋白的氨基酸序列与NOX2有50%的同源性。DUOX1和DUOX2均在甲状腺内大量表达。但DUOX1在气道上皮和前列腺内也有表达,而DUOX2在唾液腺的管道内、直肠的黏膜层,包括十二指肠、结肠和盲肠在内的全程胃肠道管道以及气道上皮和前列腺中均有表达。分布于甲状腺细胞质膜顶部滤泡腔内的DUOX蛋白,能提供甲状腺球蛋白酪氨酸残基交联和甲状腺过氧化物酶介导的碘化作用所需的H2O2,并能调节甲状腺激素的合成;胃肠道和呼吸道内分布的DUOX可能与炎性刺激引起的宿主防御有关。1.7亚甲基族的调整1.7.1nadph氧化酶抗体的构建人p22phox基因位于16号染色体q24,其蛋白相对分子质量约22000,由195个氨基酸组成。跨膜亚基p22phox有两个主要功能:一是与NOX蛋白结合,维持NOX蛋白的稳定性;二是与组织亚基相互作用,完成NADPH氧化酶复合体的组装。研究发现,p22phox在NOX1、NOX2、NOX3和NOX4四个NOX亚型活化时发挥一定作用,转染实验敲除p22phox后会导致NOX1~4复合体的活性降低,但NOX5的活性不受影响。p22phox在成人和胎儿的多数组织中都有分布,如大脑、心脏、肾脏、肝脏、肺、脾和甲状腺等。1.7.2与33的体外形态NOXO1是p47phox的同源物,两者在NOX活化过程中发挥组织作用,因此都被称为组织亚基。p47phox和NOXO1基因分别位于7号染色体q11.23和16号染色体p13.3,相对分子质量分别约为47000和41000,分别由390和370个氨基酸组成。p47phox在骨髓细胞内高度表达,在睾丸、内耳、神经元、肝细胞、肝星形细胞、肾小球系膜细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞等组织和细胞中有低水平的表达;而NOXO1不仅在结肠内有高水平的表达,而且在睾丸、子宫、肝、胰腺、肾脏和内耳等组织中均有表达。NOXO1在结肠和内耳内的丰富表达,与NOX1和NOX3在该两种组织中的高表达有一定的相关性。1.7.3蛋白整体结构NOXA1是p67phox的同源物,两者调节了NOX活化及装配的过程,因此被称为调节亚基。p67phox和NOXA1基因分别位于1号染色体q25和9号染色体q34.3,其蛋白相对分子质量约为67000和51000,分别由562和483个氨基酸组成。p67phox在吞噬细胞、淋巴细胞、肾小球系膜细胞、内皮细胞、神经元、星状细胞、肾脏和肝星形细胞中有表达,而NOXA1在脾脏、内耳、胃、结肠、小肠、子宫、前列腺、肺、甲状腺、唾液腺、荷兰猪的胃粘膜细胞、基底动脉的内皮细胞等组织和细胞中有表达。1.7.4p40phol对nox诱导的诱导表达人p40phox基因位于22号染色体q1,3.1,其蛋白相对分子质量大约为40000,由339个氨基酸组成。p40phox在吞噬细胞、淋巴细胞以及其他一些表达NOX2的细胞内有丰富表达,但在丰富表达NOX2的血管细胞内没有发现p40phox,同时p40phox表达较高的神经细胞内也没有发现NOX2。研究表明,p40phox在p47phox缺失时,协同p67phox和Rac参与了NOX2的活化,可能的机制是p40phox能够与膜亚基p22phox结合。p40phox不是NOX2活化过程中必不可少的亚基,它的存在能够促进NOX2活化;在NOX1、NOX3和NOX4活化复合体的组装过程中p40phox不发挥作用,所以p40phox可能仅存在于表达NOX2的细胞中。1.7.5rac对nox3的表达Rac1、Rac2、Rac3和RhoG共同组成RacGTP酶家族,研究发现Rac1和RhoG在机体内广泛表达,Rac2只在造血干细胞中有表达,Rac3的表达最初被确定为仅限于神经系统,但现在认为多数组织中都有表达。Rac参与调控NOX1和NOX3的活化过程,但在NOX3活化中是否发挥作用还有争议。目前仍没有证据表明Rac参与NOX4和NOX5及DUOX等活化的数据。2nox家族及其结构2.1n末端的蛋白结构NOX蛋白结构的特异性决定了家族各成员的活性、功能等的差异,七个成员根据其蛋白质分子的结构不同分为三组,NOX家族三组蛋白结构示意图如图1所示。第一组由NOX1~4四个NOX蛋白组成,它们的蛋白分子包括两大结构域:部分伸向胞浆的C末端和疏水跨膜区N末端。其中C末端有一个黄素蛋白脱氢酶区,包含NADPH-和FAD-结合位点;N末端有六个保守的跨膜区,也叫跨膜α单环。其中在第三个和第五个跨膜区各有两个结合亚铁血红素的保守组氨酸残基,为带有两个不均衡血红素的铁提供了支撑轴和远端配体。跨膜螺旋组氨酸残基的模型表明,两个血红素大概位于膜内外的小叶上,并且垂直于膜双层,为氧上丢失的电子经过细胞质NADPH和FAD,穿过膜到达血红素,最后穿透细胞形成活性氧提供了通道。NOX5单独被列为第二组,除包含有NOX1~4的结构域外,还在N末端有四个EF手结构域,此结构域被认为是钙离子(Ca2+)的结合位点,认为钙离子的结合改变了EF手结构,使其更易与催化区域结合。NOX家族蛋白的第三组是DUOX氧化酶,它不仅包含NOX1~5的结构域(与NOX5不同的是,其有两个EF手结构),而且还在N末端有一个髓过氧化物酶样胞外域,即图1中的类超氧化物酶样区域,也称第七个跨膜区,因此称DUOX酶为双功能氧化酶。2.2mo不同结构的磷酸化程度和同源性调节亚基是NOX酶复合体形成及活化所必需的,其结构示意图如图2。p22phox的N末端与NOX结合,C末端有一个结合p47phox的脯氨酸富集区(prolinerichregion,PRR)。磷酸化的p47phox是NOX活化组装过程中的触发器,包含多元的C末端PRR区和自动抑制区(auto-inhibitoryregion,AIR)、中间的bis-SH3区(Srchomology3,Src同源3结构区)和N末端的吞噬细胞氧化酶区(phagocyticcelloxidation,PX)。其中AIR区包含多个丝氨酸残基,是磷酸化的激发位点。NOXO1与p47phox不同的是缺少多元的自动抑制区和调节磷酸化的位点。当外源性刺激存在时,p47phox的AIR区丝氨酸残基磷酸化,同时PRR区与p67phox和p40phox的SH3区结合,组织胞质亚基向胞膜迁移。p67phox和NOXA1仅有28%的同源性,结构上都包括C末端的SH3区、一个较保守的PB1(PhoxandBem1)区、一个高度保守的活化区(activationdomain,AD)和N末端的TPR(tetratricopeptiderepeats)区。其中SH3区结合p47phox,而PB1区与p40phox的PB1区的结合调节了p40phox与PHOX调节蛋白复合物的结合,TPR区有RacGTPase的结合位点。但与p67phox不同的是,NOXA1的类PB1结构缺少一个保守的赖氨酸残基,所以不能与p40phox结合。p40phox的结构包括一个SH3区、一个PX区和一个PB1区,其SH3区域能够与p67phoxC末端的SH3区域一起竞争结合p47phox的PRR区,表明一些结合亚基的重排可能发生在组装或是活化过程中。3膜结合亚基的诱导表达只有当NOX家族蛋白亚型与跨膜亚基和胞浆亚基结合,并组装成有活性的复合体后才能发挥其生物学功能,其中胞浆亚基向胞膜迁移后与NOX蛋白组装成复合体是NOX蛋白活化的基础。不同的细胞亚基在NOX酶复合体组装及活化的过程中发挥不同的作用。其中p22phox是膜结合亚基,不仅参与了NOX蛋白的固定,而且招募胞质亚基p67phox、p47phox、p40phox和胞质小分子GTP酶结合蛋白Rac向胞膜移动。p67phox的N末端具有分别与小分子GTP酶结合蛋白Rac和p40phox结合的区域,从而诱导了Rac和p40phox向细胞膜的迁移。p47phoxC末端的PRR区可以与p67phoxC末端的SH3区结合,从而发挥募集胞质亚基p67phox、p40phox和Rac的作用。p40phox的PX区与膜磷脂紧密结合,在NOX2的活化过程中发挥招募蛋白质复合物的作用。3.1padph氧化酶体的构建吞噬细胞NADPH氧化酶通常是静息的,当机体受到外界胁迫因子,如射线、紫外线、重金属、环境污染及细菌等刺激时,NADPH氧化酶胞质亚基p47phox发生磷酸化,导致其构象改变,分子间的紧密结合打开,AIR区被释放,同时SH3区和PX区暴露出来,随后p67phox利用其C末端的SH3区结合p47phox的PRR区,磷酸化的p47phox携带p67phox、p40phox和Rac向细胞膜迁移,最后利用N末端暴露的SH3区与伸向胞质中的p22phox的PRR区结合,最终实现胞膜亚基单位与胞质亚基单位在细胞膜上的集合与装配,在胞膜上形成有活性的NADPH氧化酶复合体,该复合体组装并产生超氧化物的示意图如图3所示。某些静息的非吞噬细胞中也有NOX2的表达,活化模式是相同的,只是活性比较低。3.2nox1的活化NOX1的活化需要膜亚基p22phox及胞质亚基NOXO1/p47phox、NOXA1/p67phox和Rac1,p40phox不参与NOX1的活化。当p47phox缺失时,由于NOXO1磷酸化调节位点的缺失和PX区与静息细胞膜结合能力的丧失,NOX1的活化依赖NOXA1的活化区域;但当NOX1活化时,亚基NOXO1仍旧会与p22phox的PRR区结合。当NOXO1缺失时,Rac1被激活,Rac-GTP结合NOXA1的TPR区域,最终NOX1被Rac-GTP调控活化。与经典的NOX2-p47phox-p67phox-Rac活化系统需要蛋白磷酸化和脂质磷酸化不同,NOX1活化系统中Rac1鸟苷酸的改变可能是目前唯一被确定的活化触发点,但是NOX1通过Rac1的活化仅在细胞内NOXO1和NOXA1水平较低时发生。除了NOXO1和NOXA1,NOX1还表现出一种独特的能力,即当细胞中NOXO1伴随p67phox表达,或是NOXA1伴随p47phox表达时也能活化,但异源亚基调节的NOX1活性要比同源亚基调节的低。3.3nox3活的调控NOX3在p22phox存在而其他调节亚基缺失的情况下能产生少量的ROS,因为NOX3能与p22phox单独形成一个复合物,但调节亚基的存在能够明显增加NOX3的活性。NOX3活化时,亚基的调控根据物种的不同而各异,人的NOXO1在NOXA1或p67phox缺失时能够调节NOX3的活化,但鼠的NOX3活化同时需要NOXO1和NOXA1。目前的研究发现Rac1在NOX3活化调节中不发挥作用,因为Rac1的显性失活和组成型激活突变形式均不会影响NOX3的活化。3.4phos1、p65pwell、noxa1的变化在遇到佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)或钙离子这样的刺激源时,NOX4均能表现出高度的活性,而且NOX4的活性不受调节亚基p47phox/NOXO1、p67phox/NOXA1和Rac的影响,仅与p22phox有密切的相关性。与NOX1~3活化模式不同的是,NOX4活化不依赖p22phox的PRR区,这可能与p47phox或NOXO1的缺失有关。免疫共沉淀结果表明NOX4与p22phox共定位于人的肾组织,这些发现表明NOX4-p22phox复合体在没有其他调节亚基辅助时也能产生ROS,其他一些研究也表明一些细胞中NOX4能够被迅速激活,但机制仍不清楚。例如,胰岛素在5min内能够激活NOX4产生ROS,这一迅速的反应只能靠NOX4蛋白表达量增加来解释,而脂多糖通过TLR受体信号级联在30min后才能激活NOX4。3.5钙离子浓度对nox活性的影响除了NOX1~4的基础NOX催化结构外,NOX5在N末端还有四个结合钙离子的EF-手结构,研究认为钙离子的结合改变了EF手结构,使其更易与催化区域结合,这一过程促使电子从NADPH转移到氧形成超氧化物,所以单独存在的钙离子就能激活NOX5,但只有在钙离子浓度比生理环境中的钙离子浓度高时才能诱导NOX5的活化。研究表明,PMA能够触发NOX5T494和S498的磷酸化,增加其对钙离子的敏感性,所以NOX5的活化可能涉及钙离子和氨基酸残基磷酸化通路两个方面的相互协调。3.6duol2p2px抑制剂与其他k-ros的交叉作用人的DUOX酶类似于NOX5,包含EF手结构,虽然是两个而不是四个,但不影响与钙离子的结合。钙离子结合区域的存在解释了在丰富表达DUOX的甲状腺细胞和人类支气管细胞中钙离子触发了ROS的产生。报道显示人类DUOX2能够与p22phox结合,但p22phox对DUOX酶的活化仅发挥很小的作用,甚至不起作用。在经典的NADPH氧化酶活化模式中,p22phox是NOX2糖基化和膜上定位所必需的,所以与DUOX蛋白相关的p22phox也可能发挥类似的作用。4nox家族的功能4.1nadph氧化酶系统的结构虽然不同的NOX亚型可能有物种、哺乳动物和组织分布的差异,但NOX家族分布的广泛性决定了其蛋白功能的全面性。生理过程中的NOX蛋白参与调控细胞生长、分化、凋亡和细胞骨架重塑,而且某些NOX亚型具有特殊功能,如宿主防御(NOX2)、内耳中耳石的形成(NOX3)、甲状腺激素的合成(DUOX2)和血管张力的调控(NOX2)等。NOX家族亚基过表达或是缺失与机体多个器官疾病的发生有一定的相关性。NOX源性的ROS牵涉到的疾病有慢性肉芽肿疾病、阿尔茨海默病、胃肠道炎症、高血压、动脉粥样硬化、肿瘤、甲状腺功能减退及囊肿性纤维化、类风湿性关节炎和糖尿病等。NADPH氧化酶的NOX家族主要通过活化后生成的ROS来完成生理病理功能。吞噬细胞的NADPH氧化酶在静息细胞中没有活性,在病原微生物、炎症介质、外界因子等刺激时活化产生的ROS与机体宿主防御有关。与吞噬细胞NADPH氧化酶不同的是,非吞噬细胞NADPH氧化酶在生理条件下保持一定的活性,产生胞内胞外的ROS。通过此途径产生的ROS并不主要起细胞防御功能,而是作为“信号分子”和“基因表达开关”参与了细胞分化、增殖、凋亡(细胞内源性的ROS)及细胞间的信号通路的调控(细胞外源性的ROS)。当收到胞外因子的刺激信息时,NOX家族蛋白过表达,产生过量的ROS,与人体疾病的发生发展有密切的关系。4.2机体内ros的生成ROS是一类在需氧代谢和有氧环境中形成,在分子组成上含有氧,且比氧自身有更高化学活性的物质总称。机体内的ROS有许多种来源,其主要的生成途径包括环氧化酶、细胞色素p450、内皮一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase,NOS)、脂肪氧化酶、线粒体呼吸、NADPH氧化酶NOX家族、黄嘌呤氧化酶(xanthineoxidase,XO)和髓过氧化物酶(MPO)等。4.3其它an型活性氧化学因素(氧化还原反应、电子传递、金属离子催化、药物等)、物理因素(射线、光、热等)和生物因素(酶的催化)都可诱导细胞内产生高浓度的ROS;同时,许多细胞在氧化应激或是生理代谢过程中均能产生一定量的ROS。机体产生的这些ROS有两种类型:一种是外层分子轨道包含一个或多个未成对电子的自由基ROS,包括超氧阴离子自由基(O2·-)、羟自由基(·OH)、过氧亚硝酸盐自由基(peroxynitrite,ONOO-)和次氯酸盐自由基(hypochlorite,OCl-)等;另一种是不包含未配对电子,但通过化学反应可转换成自由基ROS的非自由基ROS,包括过氧化氢(hydrogenperoxide,H2O2)、单态氧、臭氧和氢过氧化物等。各种活性氧的生成过程如图4所示。机体内NADPH氧化酶NOX家族活化产生的ROS主要是O2·-,而H2O2和·OH分别是O2·-和H2O2的产物。O2·-是NOX蛋白活化的主要产物,通过分子氧一个电子的缺失而形成,具有高度的活性,但寿命较短,通常在水溶液中不会发生有害反应,当自发或通过锰超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)催化生成H2O2及金属离子将H2O2催化生成·OH时才表现出毒性。由于O2·-带有负电荷,因此不能穿透细胞膜,而是通过特定的电压离子通道转运到胞质中,作为信号分子参与细胞内信号转导。O2·-与一氧化氮(nitricoxide,NO)反应产生的ONOO-,也是一种参与硝化反应的强氧化剂。理论上讲,SOD和NO都为O2·-的清除剂,但O2·-通过SOD生成H2O2的速率仅为O2·-与NO反应速率的三分之一。4.4ros的剂量迄今为止,国内外的研究均已证实ROS的作用存在剂量-效应关系,如海春旭研究表明,加入或通过一定体系激发产生ROS,其产生的量对细胞的发展和归宿具有剂量-效应影响。当ROS剂量较低时,可改变细胞功能或活性状态;中等剂量可导致细胞凋亡;剂量过高时则可造成细胞结构的损伤,甚至导致细胞死亡。这些研究结果提示,ROS对细胞功能的影响存在一定的剂量-效应关系。4.4.1ros信号分子的调节作用ROS参与机体内的信号转导,与细胞的发展及归宿密不可分。ROS是机体生理功能的基础,通过直接反应调节多种信号转导、修饰蛋白结构、转录因子和基因,并调节它们的功能。ROS参与细胞生长、分化、凋亡信号和酶活性的调控,通过刺激炎性因子的产生而参与炎症反应,清除病原微生物和外源物质。生长因子、细胞因子或是G蛋白偶联受体激动剂活化分泌可以引起细胞内超氧化物和过氧化氢的瞬时升高,而ROS特异性抑制剂或是H2O2清除剂能够阻断血小板衍生生长因子(plateletderivedgrowthfactor,PDGF)、表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)和血管紧张素II(angiotensinII,AngII)等诱导的信号。所以ROS可能调节生长因子和其他因子的信号通路,也可能增强了信号转导作用。ROS的作用是双刃剑,适量的ROS的增加可以促进细胞增殖、分化和凋亡;当ROS生成量超过机体调节能力时,则会触发细胞死亡(图5)。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases,MAPKs)信号转导通路在细胞增殖、分化、凋亡等生物学反应过程中具有至关重