畜禽大肠杆菌对七种常见抗菌药的敏感性试验

畜禽大肠杆菌对七种常见抗菌药的敏感性试验2023届动医专升本2班董卫超论文提要

一、前言二、材料与方法三、结果四、讨论一、前言近期随着畜禽养殖业的快速开展，大肠杆菌病已成为危害养殖业的主要传染病之一。近年来，由于长期大量抗菌药物的滥用，造成大肠杆菌耐药菌株不断产生，尤其是兽医临床已出现多重耐药性、超强耐药的大肠杆菌，即同时对兽医临床常用抗菌药物：氨基糖苷类、四环素类、氯霉素类和氟喹诺酮类等产生耐药性，导致常规药物的药效降低甚至消失，临床可供选择药物的余地越来越少，大肠杆菌病的防治难度日益增加，给养殖业造成了严重的损失鉴于畜禽大肠杆菌耐药性的普遍产生，为了更好的指导临床用药及减少耐药菌株产生，故此，对河南局部地区的畜禽大杆菌进行简单药敏分析。二、材料与方法病料：采自河南省内的养殖场。培养基：血平板培养基、营养肉汤、麦糠凯琼脂、大肠杆菌显色培养基等。抗菌药物名称：阿米卡星、强力霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、克林沙星、加替沙星、SMM/TMP(5:1)。仪器：洁净工作台、LRH-250-Ⅱ微电脑控制生化培养箱、96孔V型反响板、BS224S型电子天平等。细菌的别离培养与保存

内脏病死动物血平板划线37℃培养24h接种入新鲜肉汤37℃培养24h肉汤培养基麦康凯划线培养4℃保存备用挑取单个菌落接种肉汤培养24h疑似大肠杆菌菌液

药液的配制用电子天平称取适量的各种药物无菌配制成浓度为1280μg/mL的药液5mL。

恩诺沙星

氟苯尼考

克林沙星少许NaOH+无菌蒸馏水少许NaOH+无菌蒸馏水N,N-二甲基甲酰胺+少许乙醇恩诺沙星药液氟苯尼考药液克林沙星药液菌液的配制

吸取5μL保存菌液接种于5mL新鲜肉汤中37℃过夜培养充分混匀，进行万倍稀释至105CFU/mL

吸取2μL菌液于平皿中同20mL新鲜肉汤最小抑菌浓度的测定第12列中，前4孔为阴性对照，后4孔为阳性对照。123456711812910ABCDEFGH第1列：参加各药液60μL。从后向前每孔依次参加60μL菌液至第一孔。保鲜膜覆盖后标记菌株，然后置37℃培养18~24h后，观察结果。与第一孔药液吹打混匀后，吸取60μL混合液至第二孔，吹打混匀，以此倍比稀释至第11孔。微量肉汤稀释法三、结果1细菌的鉴定观察结果2畜禽大肠杆菌对不同药物的MIC值3、畜禽大肠杆菌对各组药物的耐药率4、多重耐药谱统计1细菌的鉴定观察结果观察所别离的细菌生长情况，在麦康凯培养基上成桃红色、扁平、圆形、隆起、光滑、湿润的菌落，为疑似大肠杆菌。另外在麦康凯培养基上还培养出桃红色和黄白色透明状两种菌落，将这两种菌落分别接种于大肠杆菌鉴别培养基上做鉴别培养，结果显示：在麦康凯培养基上显示桃红色的菌落经大肠杆菌显色培养基培养呈蓝绿色的，可鉴定为大肠杆菌，而在麦康凯培养基上显示黄白色透明状的菌落，在大肠杆菌显色培养基上显示无色，所以可能是其他菌种。将确定为大肠杆菌的4℃保存备用，进入本试验。

2、不同药物对大肠杆菌的MIC值细菌氟苯尼考多西环素阿米卡星SMM/TMP(5/1)恩诺沙星加替沙星克林沙星1320160<0.6251604051.252>640160<0.625>6406401053>640160<0.625>640160102.510640160<0.625>64040102.512640160<0.625>6402051.2514640160<0.625>64064052.519160201080102.51.2521640160320>64080101.252264016080>640202.51.252458020801051.25273206401.2564040402.52864080<0.625>6406402010296401601.25>640801053016080<0.625>6402051.2531640801.25>640640202.53364080640>640640202.53464016020>640320102.53、畜禽大肠杆菌对各组药物的耐药率MIC值测得结果1药物耐药浓度(μg/mL)耐药株数MIC范围(μg/mL)MIC50(μg/mL)MIC90(μg/mL)耐药率(%)多西环素≥161720~640160160100恩诺沙星≥41710~64080640100氟苯尼考≥8165~>640640>64094.1SMM/TMP≥5121480~>640>640>64082.4加替沙星≥8102.5~40102058.8阿米卡星≥643<0.625~6401.2532017.6克林沙星≥811.25~102.555.94、多重耐药谱统计四、讨论1受试菌株对多西环素、氟苯尼考药物的耐药性情况及分析。2受试菌株对喹诺酮类抗菌药耐药性的差异。3阿米卡星对不同种属受试菌株MIC的差异。阿米卡星MIC比照4多重耐药性及标准用药。1受试菌株对多西环素、氟苯尼考药物的耐药性情况及分析讨论

受试菌株对四环素类的多西环素、氯霉素类的氟苯尼考药物耐药性较强，耐药率分别为100%、94.1%。分析其原因可能是由于四环素类药物作为保健药物长期拌料使用而引起的交叉耐药性，如：土霉素等；氟苯尼考自作为动物专用抗菌药物以来被长期大量滥而使细菌对其敏感性逐步降低以致产生大面积耐药菌株的产生。据有关资料称大多抗菌药物如β-内酰胺类、氯霉素、磷霉素、氨基糖苷类药物均主要通过大肠杆菌外膜蛋白(OmpF和OmpC，主要是OmpF)进入细胞内发挥抗菌作用的，推测对这类抗菌药物的耐药机制可能与大肠杆菌外膜蛋白的变化有关。畜禽大肠杆菌对各组药物的耐药率2受试菌株对喹诺酮类抗菌药耐药性的差异

克林沙星、加替沙星、恩诺沙星的耐药性分别为5.9%、58.8%和100%。可见，受试大肠杆菌对同一类药物的不同种抗生素的耐药率差异较大。原因可能由于恩诺沙星长期用作动物专用药物被大量滥用所引起，而克林沙星及加替沙星较少使用。由此推测，耐药性的产生可能与此种药物的使用时间及频率成正相关。

畜禽大肠杆菌对各组药物的耐药率3阿米卡星对不同种属受试菌株MIC的差异分析表中阿米卡星的MIC值，得知猪源大肠杆菌的MIC值整体较小，其中有10株猪源大肠杆菌的MIC值不大于1.25μg/mL，禽源大肠杆菌对阿米卡星的MIC值整体明显高于猪源大肠杆菌的MIC值〔除个别的33、34号菌株较高外〕。猪源大肠杆菌对阿米卡星的耐药率为8.3%，而且对66.7%的猪源大肠杆菌MIC值均<0.625μg/mL，而阿米卡星对禽源大肠杆菌那么不及猪源大肠杆菌敏感。究其原因，可能是由于可能是由于菌源种属差异及阿米卡星在禽源大肠杆菌病和猪源大肠杆菌病的使用率不同有关。对于33、34号菌株的个别现象，推测原因，可能是由于曾经屡次使用过阿米卡星防治疾病所致。阿米卡星对不同细菌MIC值比照

4多重耐药性及标准用药受试菌株几乎均存在多重耐药性这一显现。其中常见的耐药组合为：氟苯尼考+多西环素+SMM/TMP+恩诺沙星，在17株受试菌中占82.35%。由于，动物专属药物的长期使用及交叉耐药性的产生，致使多重耐药性的产生。也就是说我们临床联合用药时，这些配伍已经对大肠杆菌效果大大减退，因此要尽量选择其他的组合进行联合用药。应该标准合理使用抗菌药物，对养殖场别离细菌进行药敏试验，加强耐药性的流行病学调查，采用合理的联合用药、交叉用药、轮换用药的方式增加药物的使用寿命方能取得良好的效果；开发有效的抑制剂等增效剂，与抗菌药物联合使用提高药物的敏感性,降低使用剂量，减少耐药性的产生。多重耐药谱统计参考文献[1]Paterson,D.L,L.Mulazimoglu,J.M.Casellas,etal.Epidemiologyofciprofloxacinresistanceanditsrelationshiptoextended-spectrumβ-lactamaseproductioninKlebsiellapneumoniaeisolatescausingbacteremia.Clin.Infect.Dis,2000,30:473~478.[2]陈杖榴主编.兽医药理学(第三版)[M].北京:中国农业出版社,2023,200~210.[3]江明性主编.新编实用药物学(第2版)[M].北京:科学出版社,2005,656~665.[4]马兴树编著.禽传染病实验诊断技术[M].北京:化学工业出版社,2005,49~54.[5]伍参荣.病原生物学(第1版)[M].北京:中国中医药出版社,2007,20~27.[6]MichaelT.MadiganJohnM.MartinkoPaulDunlapDavidP.ClarkThomasD.Brock.BrockBiologyofMicroorganisms[M].PearsonEducation,2023,152.[7]沈富林，王蓓，黄士新.兽药分析与检测技术[M].上海:上海科学技术出版社,2023,162.参考文献[9](美)希契纳主编,胡祥璧译.禽病原体的别离与鉴定[M].天津科学技术出版社,1987,1~14.[10]蔡宝祥.家畜传染病学(第4版)[M].北京:中国农业出版社,2001,46.[11](美)B.W.卡尔尼克主编,高福,刘文军主译.禽病学(第9版)[M].北京:北京农业大学出版社,1991,126~132.[12]EwersC,JanssenT,WielerLH.AvianpathoqenicEscherichiacoli(APEC).BerlMunchTierarztlWochenschr,2003,116(9-10):381~395.[13]NikaidoH.Preventionofdrugaccesstobacterialtargets:permeabilitybarriersandactiveeff-lux[J].Science,1994,264:382~388.[14]张宇.喹诺酮类抗菌药的研究进展[J].中国新药杂志,2006,15(16):1345~1348.[15]杜向党,张素梅,李新生,等.致病性大肠杆菌对头孢噻呋和氟喹诺酮类药物的敏感性[J].中国兽医志,2007,43(8):73.[16]嵇小琴,吕莺,李磊.细菌耐药机制研究进展[A].世界感染杂志,2007,7(6):511~514.参考文献[17]陆承平.兽医微生物学(第三版)[M].北京:中国农业出版社，2001,215~222.[18]BantarC,VescoE,HeftC,etal.Replacementofbroad-spectrumCephalosporinsbypiperac