微生物快速检测 2节2 食品微生物 免疫标记技术 2

1第二节

食品致病菌定性快速检测技术2

第四类

现代快速免疫检测技术2浙江工商大学食品与生物工程学院赵广英教授2第四类

现代快速免疫检测技术23目录序1、免疫浊度法2、分子印迹技术3、免疫传感器与食品安全快速检测4、现代免疫标记技术与食品安全快速检测

（免疫标记荧光、酶、同位素和生物素等物质）44.现代免疫标记技术与食品安全快速检测

4.1概述将将免疫标记物（指示物）标记到抗体或抗抗体上，利用它们来指示抗原和抗体特异性结合与否。免疫标记物：荧光色素、酶、放射性物质、稳定同位素12c、13c和放射性同位素14c标记、胶体金和生物素等。被标记物：将标记物标记到单克隆抗体、多克隆抗体、一般抗体和抗原等等生物活性物质上，进行免疫分析的方法。

稳定同位素：12c、13c和放射性同位素14c（c14不这样表示）54.2免疫荧光技术（immunofluorecence

technique）-标记荧光色素

用荧光素色素标记抗原或抗体，定性、定量和定位检测。敏感、定位、可定性和半定量。（1）直接法

6(2)间接法enzymeimmunoassay(EIA)C:\DocumentsandSettings\IBM\LocalSettings\TemporaryInternetFiles\Content.IE5\MJO8PCVS\elisa[1].jpg常用酶：辣根过氧化物酶HRP碱性磷酸酯酶APH2O2受氢体供氢体(底物)和颜色邻苯二胺(OPD)黄邻苯甲苯胺(OT)兰5－氨基水杨酸褐联大茴香胺(OD)桔红AnELISAplate4.3免疫酶技术（immunoenzymatictechnique）

－－标记酶后加底物反应显色(界限)

目前应用最多的免疫酶技术是酶联免疫吸附实验（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA

）间接法

双抗体夹心法111双抗体夹心间接法A-Ab*＋Ab＋Ag?＋Ab抗原竞争法(Ag?＋Ag*)＋Ab4.4同位素放射免疫测定法与免疫放射分析4.4.1放射免疫测定法定义：

放射免疫测定法(Radio-immunoassay,

RIA)是利用同位素放射测量的灵敏性和免疫反应的特异性进行徽量分析的一种方法，是饱和分析法（免疫竞争法）的一种。

美国免疫学家雅洛（R.Yalow,1921-），因创立了放射免疫法而荣获１９７７年诺贝尔生理学及医学奖。

RosalynS.YalowattheNobelBanquetinStockholm,Dec.14,1977

特点：灵敏、特异应用：可测定蛋白质、酶和多肽类激素、性腺类固醇激素。常用的同位素：

3H

、125I和131I等。

3H

可以置换有机化合物中的氢，不影响原有化学物质，且半衰期长和能量低，便于防护。125I和131I原子的化学物质比较活泼，标记方法简便，多肽、蛋白质与小分子半抗原均可进行碘标记。一些不能直接用碘标记的半抗原，通过接上一个酪氨酸亦可用碘标记之。

产品

γ放射免疫计数器放射免疫试剂盒产品：目前已制成RIA试剂盒，进一步提高了RIA的标准化和商品化程度，更利于发挥该项技术的高效水平。RIA的基本原理是利用被测抗原(Ag)与用同位素标记的标记抗原(*Ag)对它们共同的特异性抗体(Ab)”竞争”

结合反应的结果，通过放射测量来测定被测抗原的含量。然后将被测抗原(Ag)和已标记的标准抗原(*Ag)与相应抗体(Ab)放在一起。在三者同处于一个反应系统时，则Ag、*Ag竞相与Ab发生竞争结合反应。当*Ag和Ab的量保持不变，且Ag与*Ag之和大于Ab上有效结合点时，必然会出现以下反应：

*Ag（已知，定量）+Ag??（未知，待测）+Ab（已知，定量）

Ag和*Ag竞争Ab*Ag-Ab十Ag-Ab+*Ag(剩余)+Ag(剩余)“Ag-Ab”的量与Ag的多少成正相关，“*Ag-Ab”的量与Ag的多少成负相关相关。分离：将*Ag-Ab、Ag-Ab结合物与游离*Ag分开计数：经液体闪烁计数仪测出*Ag-Ab结合物的脉冲数，即每分钟的计数(Countperminute，cpm)制备标准曲线：以标准Ag的量(Pg数)为横坐标，以相应的*Ag-Ab结合物的cpm数为纵坐标，作出一条曲线.判定：这条标准曲线是测定样品中未知抗原(被测物)的唯一依据，只要用一定量的样品来代替已知的标准抗原，其他条件不变，同样可以测出各个*Ag—Ab结合物的cpm数，用cpm数标准曲线上查找，便可得到相应的Ag含量，即被测物质的含量。放射免疫竞争法分析基本原理图“Ag-Ab”的量与Ag的多少成正相关，“*Ag-Ab”的量与Ag的多少成负相关相关。＋＋被分开被测抗原多同位素标记Ag（已知，定量）Ag（未知，待测）Ab（已知，定量）Ab-Ag复合物Ab-标记Ag复合物感作19免疫放射分析免疫放射分析法(immunoradiometric

assay,IRMA)是从放射免疫分析（RIA）的基础上发展起来的同位素标记免疫测定技术。特点：用同位素标记的抗体直接与受检抗原反应并用固相免疫吸附剂吸附分离没有结合抗原的游离标记抗体。在免疫检验中取得了广泛应用。IRMA的原理其原理与ELISA极为相似，不同点主要为标记物为核素及最后检测的为放射性量。单位点IRMA的反应模式如图：抗原与过量的标记抗体在液相反应后加入免疫吸附剂，即结合在纤维素粉或其他颗粒载体上的抗原。游离的标记抗体与免疫吸附剂结合被离心除去，然后测定上清液的放射性量。

单位点IRMA原理示意图

测定上清液的放射性量离心除去已知的过量的标记抗体双位点IRMA双位点IRMA原理示意图

双位点IRMA的反应模式与双抗体夹心ELISA的模式相同。

受检抗原与固相抗体结合后，洗涤，加放射性同位素标记的抗体，反应后洗涤除去游离的标记抗体，测量固相上的放射性量。不论是单位点还是双位点IRMA，最后测得的放射性与受检抗原的量呈正比。IRMA与RIA的异同点

1．标记物在RIA中核素标记抗原，在IRMA中核素标记抗体。抗原有不同种类，根据其化学结构，标记时需用不同的核素和不同的方法。抗体为蛋白质，有利于碘化标记，不同抗体标记方法基本相同。标记抗体的比活度高，提高了分析的灵敏度。2．反应速率反应速度与反应物的浓度呈正比，在IRMA中标记抗体是过量的，而且不存在竞争性结合复杂的反应，所以反应速度较RIA快。在RIA中抗体量是微量的，所以一定要用高亲和力的多克隆抗体，而在IRMA中应用亲和力较低的单克隆体也能得到满意的结果。3．反应模式RIA为竞争抑制，测得放射性的量与受检抗原呈反比。IRMA为非竞争结合，剂量反应曲线为正相关的直线关系。4．特异性在比位点IRMA中，一般均应用针对不同位点的单克隆抗体，其交叉反应率低于应用多克隆抗体的RIA。5．标准曲线的工作浓度通常RIA的工作范围为2～3个数量级，而RIMA可达3个数量级以上。6．分析误差RIA中加入的抗体和标记抗原都是定量的，加样误差可严重影响测定结果。IRMA中标记和固相抗体在反应中都是过量的，只有受检标本的加样误差才会影响分析结果。因此，IRMA的批内和批间变异均比较小。7．其他RIA可以测定大分子量与小分子量的物质，双位点IRMA只能测定在分子上具有2个以上抗原表位的物质。在RIA中应用的多为克隆抗体，亲和力和特异性要求较高，但用量很少。IRMA中标记抗体和固相抗体用量较多，一般均用来源丰富、特异性较高的单克隆抗体。

项目RIAIRMA被标记物标记抗原标记抗体反应速度竞争反应，较慢直接反应，较快对抗体的要求抗体量是微量的，一定要用高亲和力的多克隆抗体IRMA中应用亲和力较低的单克隆体即可反应模式RIA为竞争抑制，测得放射性的量与受检抗原呈反比IRMA为非竞争结合-夹心法，剂量反应曲线为正相关的直线关系。抗体和交叉反应率应用多克隆抗体，亲和力和特异性要求较高，但用量很少，其交叉反应率较高需用单克隆抗体，交叉反应率较低。抗体用量较多，多用来源丰富、特异性较高的单克隆抗体。标准曲线的工作浓度通常的工作范围为2～3个数量级，

可达3个数量级以上分析误差和一致性分析误差RIA中加入的抗体和标记抗原都是定量的，加样误差可严重影响测定结果。标记和固相抗体在反应中都是过量的，只有加样误差才会影响分析结果。故IRMA的批内和批间变异均比较小被测物的大小可以测定大分子量与小分子量的物质，

双位点IRMA只能测定在分子上具有2个以上抗原表位的物质。IRMA与RIA的异同点

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3、稳定性同位素C13标记:（不是免疫的）

“吹口气查胃病”：幽门螺杆菌

原理：幽门螺杆菌(HP)具有人体不具有的尿素酶，受检者口服C13标记的尿素，如有HP感染，则尿素被尿素酶分解生成NH3和13CO2

，用质谱仪能快速灵敏地测出受检者呼气中13CO2的量，准确地鉴定是否被HP感染。

幽门螺杆菌(HP)--尿素酶—分解同位素标记的尿素－产生13CO2－－质谱仪检测4.5生物素标记生物素

生物素(biotin，B)又称为辅酶R或维生素H。生物素源于动、植物，也可人工合成。生物素的分子中有两个环状结构，其中I环为咪唑酮环，是与亲合素结合的主要部位；II环为噻唑环，上有一戊酸侧链，其末端羧基是结合抗体(氨基)和其他生物大分子的唯一结构。生物素可成为带有多种活性基团的衍生物－活化生物素

亲合素＋＋抗体等亲合素亲合（和）素(avidin，A)亦称抗生物素蛋白、卵白素，是从卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白。等电点(pI)为10-10.5，含糖约l0％，分子量为68kDa。纯品为白色粉末，易溶于水，在pH9-13的溶液中性质保持稳定，耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用，80℃加热2min，仍保持活性，特别是和生物素结合后十分稳定。但对强光和Fe2+比较敏感。亲合素由4个相同的亚基组成，能结合4个分子的生物素。亲合素与生物素之间的亲和力极强，二者结合的亲和常数(Ka)为1015mol-1，比抗原与抗体的亲和力(Ka：105-11mol-1)至少高1万倍，因此二者能快速结合，而且反应不受外界干扰，具有高度特异性和稳定性。

生物素和亲和素

29链霉亲合素链霉亲合素(streptavidin，SA)，是链霉菌在培养过程中分泌的一种蛋白质产物。1L培养液中约含SA10-60mg，主要通过α亚氨基生物素琼脂糖凝胶亲和层析法提纯。SA的分子量为65KDa，内4条序列相同的肽链组成。如同亲合素一样，一个SA分子也能结合4个生物素分子，二者亲和常数亦为1015mol-1。SA的每条肽链含159个氨基酸残基，其中赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸的含量比亲合素少，反之酸性氨基酸含量较多，因此SA是一种稍偏酸性的蛋白质，其pH为6.0，并且不带任何糖基。

3070年代后期在免疫酶技术中利用生物素-亲和素系统(Bioti