动物细胞工程

动物细胞工程

就是从动物机体中取出相关组织，将它分散成单细胞，然后,放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。1、概念：一、动物细胞培养动物胚胎或幼龄动物的组织、器官胰蛋白酶剪碎单个细胞加培养液细胞悬浮液10代细胞部分细胞“癌变”，无限传代动物细胞培养不能最终培养成动物体50代细胞原代培养传代培养细胞贴壁剥离、分瓶细胞2、培养过程：分化程度低，增殖能力强去掉组织间蛋白3、几个重要的概念细胞贴壁悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上(单层)。要求：培养瓶（皿）内表面光滑、无毒、易于贴附。接触抑制

细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量不断增加，最后形成一个单层，此时细胞间相互接触，细胞分裂和生长停止，数量不再增加。原代培养传代培养

当原代培养的细胞生长停止，这时如果要使细胞继续生长，就要及时用胰蛋白酶等，使细胞从瓶壁上解离下来，然后加入新的培养液，将细胞分离稀释，并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内的过程。

把第1代细胞的培养与传10代以内的细胞培养统称为原代培养。

细胞株

传到40-50代后有部分细胞遗传物质发生了变化，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，可能在培养条件下无限制的传代下去。

从原代培养细胞群中筛选出进行传代培养的细胞，能传到40-50代，其遗传物质没有发生变化。

细胞系细胞悬浮液10代细胞50代细胞无限传代原代培养传代培养细胞株细胞系细胞贴壁生长随细胞增多，出现接触抑制部分细胞癌变，失去接触抑制，无限传代4、动物细胞培养条件能否用胃蛋白酶代替胰蛋白酶？无菌、无毒的环境（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）营养（葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清、微量元素等）温度和PH温度36.5+0.5度，pH7.2～7.4气体环境O2和CO2（95%空气和5%CO2）离体培养的细胞对微生物和有毒物质没有防御能力。保证细胞顺利的生长增殖CO2培养箱

哺乳动物离体细胞培养和体内细胞一样,需要在恒足温度下才能生存,温差变化一般不应超过0.5度，因此培养箱对温度应具有较高灵敏度。

CO2培养箱的优点在于能恒定地供应一定量的CO2,一般5%即可维持培养液PH值稳定。培养基的类型天然培养基：合成培养基：营养价值高，成分复杂。成分明确，便于控制试验条件。5、动物细胞培养技术的应用（1）生产蛋白生物制品：病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等；（4）用于检测有毒物质；（2）获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮；（3）作为基因工程的受体细胞;（5）用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据。6、植物细胞和动物细胞培养的比较比较项目植物组织培养动物细胞培养原理培养基性质培养基特有成分培养结果培养目的获得细胞或细胞分泌蛋白细胞的全能性细胞株、细胞系植物体快速繁殖、培育无病毒植株等葡萄糖、动物血清促生长因子蔗糖、植物激素液体培养基固体培养基细胞增殖1、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞是（）

A．细胞系B．细胞株

C．原代细胞D．传代细胞2、动物细胞工程技术的基础是（）

A.动物细胞融合B.单克隆抗体

C.胚胎移植D.动物细胞培养AD3、用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞（）

A.容易产生各种变异B.具有更强的全能性

C.取材十分方便D.分裂增殖的能力强D4.动物细胞培养与植物细胞培养的重要区别在于（）A.培养基不同；B.动物细胞培养不需要在无菌条件下进行；C.动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能；D.动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培养成植株。D二、克隆技术一般指DNA分子扩增。由一个细胞分裂所形成的细胞群体。指基因型完全相同的个体或群体。分子水平：细胞水平：个体水平：

克隆就是无性繁殖，具体地说，是指一个共同的祖先，通过无性繁殖的方法产生出来的一群遗传特性相同的DNA分子、细胞或个体。动物细胞特点分化潜能变窄：

随着细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜能变窄，这是就细胞整体而言。细胞核仍具有全能性：

细胞核含有保持物种遗传性所需的全套基因，而且并没有因细胞分化而丢失基因，因此高度分化细胞的细胞核仍具有全能性。1997年英国伊斯维姆.穆特等运用羊的体细胞（乳腺细胞）克隆出了羊—克隆羊“多莉”。细胞分化程度

，恢复全能性

。核移植（难度高）三、动物体细胞核移植技术胚胎细胞核移植体细胞核移植细胞分化程度

，恢复全能性

。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物。1.概念：

将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。低容易高困难卵母细胞黑面母绵羊白面母绵羊乳腺细胞细胞核移植早期胚胎C母绵羊子宫胚胎移植多莉羊分娩妊娠融合后的卵母细胞2.体细胞核移植过程卵原细胞卵细胞卵原细胞卵细胞和极体次级卵母细胞第一极体MⅡ期：减数第二次分裂中期卵母细胞作受体细胞的原因：体积大，易操作；含有激发细胞核全能性的物质。去核的方法有哪些？

目前核移植技术中普遍使用的去核方法是显微操作去核法。还有人采用其他方法，如梯度离心、紫外光短时间照射、化学物质处理等。这些方法是在没有刺破透明带或卵母细胞质膜的情况下，去除细胞核或使卵细胞核DNA变性，从而达到去核目的。细胞核核移植供体细胞（供核）细胞培养体细胞卵母细胞（MⅡ期：供质）去核无核卵母细胞注入细胞融合重组细胞重组胚胎胚胎移植代孕母体与供体奶牛遗传基础相同的犊牛2.体细胞核移植过程分娩妊娠激活四、体细胞核移植技术的应用前景1、加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育2、保护濒危物种，增加存活数量3、克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白4、可以作为异种移植的供体，可以用于组织器官的移植五、体细胞核移植技术存在的问题胚胎移植后动物幼体产出概率＜10％；克隆动物存在着健康问题；克隆动物的食品安全性问题存在争议。

2.2.2动物细胞融合与单克隆抗体

为什么“甲流”康复者或接种疫苗1月以上者的血浆会成为救治重症“甲流”患者的妙药？

血浆中的抗体会与“甲流”病毒反应，从而将病毒消灭。获得抗体的传统方法

把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需的抗体。缺点：

人们发现，B淋巴细胞尽管可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每一个B细胞只分泌一种特异性抗体。怎样才能获得大量的单一性抗体呢？产量低纯度低特异性差怎样才能获得单一性抗体？大量克隆单一的B淋巴细胞其寿命仅有几天，无法长期体外培养动物细胞培养技术骨髓瘤细胞无限增殖杂交瘤细胞产生抗体无限增殖细胞融合G.Kohler

C.Milstein

英国科学家米尔斯坦和科勒于1975年设计和实践了这个想法，并获得成功。摘得1984年诺贝尔生理及医学奖。一、动物细胞融合技术1.概念：

动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。

融合后形成的具有两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。2、动物细胞融合基本原理细胞膜的流动性3、诱导方式物理法：化学法：生物法：灭活的病毒电激、振动、离心聚乙二醇（PEG）如：仙台病毒为什么要用灭活的病毒？仙台病毒物理/化学方法丧失感染活性保留融合活性

灭活的病毒灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面细胞膜被病毒颗粒穿通细胞融合，形成杂种细胞4、植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较比较项目植物体细胞杂交动物细胞融合细胞融合原理细胞融合的方法诱导方法用途获得杂种植株细胞膜的流动性细胞膜的流动性去除细胞壁后诱导原生质体融合使细胞分散后诱导细胞融合物理（离心、振荡、电刺激）化学（聚乙二醇）物理、化学方法（同左）制备单克隆抗体灭活的病毒二、单克隆抗体的制备用抗原免疫小鼠骨髓瘤细胞的培养B淋巴细胞骨髓瘤细胞融合多种细胞由于培养基中缺乏相应的营养物，骨髓瘤细胞死亡B淋巴细胞培养几天后死亡杂交瘤细胞置于选择培养基上培养多孔细胞培养板阳性克隆的筛选和克隆化培养用培养液稀释注射到小鼠体内体外培养

由单个杂交瘤细胞通过克隆，所产生的化学性质单一、特异性强的抗体。单克隆抗体整个制备过程为何要经过两次筛选?第一次筛选：第二次筛选：用特定的选择培养基筛选出多种杂交瘤细胞筛选出能产生所需抗体的杂交瘤细胞。三、单克隆抗体的特点和应用“生物导弹”＝单克隆抗体＋药物诊断试剂用于治疗疾病1、特点：特异性强，灵敏度高，产量高。2、应用：用于运载药物优点：准确，高效，快速练习1、动物细胞融合技术最重要的用途是（）

A.克服远源杂交不亲和B.制备单克隆抗体

C.培育新物种D.生产杂种细胞B2、单克隆抗体是由下列哪种细胞产生的（）

A.B淋巴细胞B.T淋巴细胞

C.骨髓瘤细胞D.杂交瘤细胞D3、单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（）①淋巴细胞②小鼠骨髓瘤细胞③B淋巴细胞自身融合细胞④小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞⑤杂交瘤细胞

A.②④B.①③⑤C.①②③④D.②③CB体外培养骨髓瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞群注射到小鼠腹腔AC

4、下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的实验方案制备单克隆抗体不能，没有将抗原注入小鼠体内，无法获得产生单一抗体的B淋巴细胞。(1).该实验方案的目的是：________________(2).该方案能达到预期效果吗？为什么？(3).A是从小鼠的脾脏中取得__________该细胞能够产生______。(4).图中B为________________过程，常用_________________作为诱导剂，该细胞继承___________的遗传特性，既能__________,又能___________。(5).C过程指细胞培养，该过程包括