《卫生微生物学》

第三军医大学环境卫生学教研室《卫生微生物学》第八章土壤微生物预防、检验5年制本科2007级陈济安讲师授课内容攻关的任务、考核目标及主要技术经济指标第三军医大学环境卫生学教研室土壤生境特征土壤微生物的来源、种类、分布及其卫生学意义土壤微生物的检测与卫生标准土壤微生物污染的预防土壤微生物研究的前景（重点）第一节土壤生境特性土壤固相成份：矿物质和有机质矿物质：微生物生长所需的常量和微量元素有机质：微生物生长所需的碳源、氮源和能源不同地区和种类的土壤中微生物的分布千差万别土壤的水分水使矿物质处于溶解状态，利于微生物利用，利于微生物分泌的酶降解有机质，使微生物处于正常生理状态。不同类型土壤的保水性不同，不同深度土壤含水量各异，导致土壤中微生物的种类和数量的存在较大差异。土壤生境特性土壤的酸碱度土壤一般呈中性或弱碱性，适于大多数微生物生长。不同酸碱度土壤，微生物类型各异。偏酸性，真菌活动旺盛；微碱性，适合放线菌生长；中性，适合细菌生长繁殖。土壤的温度土壤具有保温性，利于微生物生长繁殖。不同地区和不同季节土壤的温度不同，微生物的种类和数量也有所差异。土壤生境特性土壤的空气土壤空隙中的空气是需氧微生物生长的氧气来源。空气的多少不但影响土壤氧化还原能力，也决定了土壤中微生物的类群。空气充足，需养微生物；空气缺乏，厌氧微生物。土壤微生物活动也是甲烷、一氧化碳、二氧化碳等温室效应气体的重要来源，参与土壤气体和大气之间的交换。土壤生境特性78第二节土壤微生物的来源、种类、分布及其卫生学意义一、土壤微生物的来源土壤微生物“土著”微生物外来微生物天然栖居对物质的分解、代谢、转化起着极为重要的作用化学元素参与生物地球化学物质循环的重要推动者随雨水、动植物残体、堆肥或受污染水体进入土壤几乎不参与土壤生态学上重要的物质转化作用有些很快从土壤消失，有些短暂存留，有些短期生长二、土壤微生物的种类土壤微生物细菌真菌其他微生物：藻类、原生动物、病毒放线菌：数量最多，土壤微生物总数量的70-90%微生物种类每克土壤中的数量细菌108～109

cfu放线菌107～108

cfu真菌105～106

cfu二、土壤微生物的种类土壤微生物细菌真菌其他微生物：藻类、原生动物、病毒放线菌参与氮素循环：氨化细菌、硝化细菌、反硝化细菌，固氮细菌等参与碳素循环：纤维素分解菌外来菌中的致病菌随人畜粪便、动物尸体及医院废弃物进入土壤并生存一定时间。沙门氏菌35～70天志贺氏菌1个月霍乱弧菌8～16天土壤表面：日照和干燥因素影响，微生物不易生存地表5～30cm土层：微生物数量最多深层土壤：有机物含量少、缺氧影响，微生物随着土壤深度增加而减少三、土壤微生物的分布深度（cm）细菌放线菌真菌藻类3～8975000020800001190002500020～25217900024500050000500035～40570000490001400050065～751100005006000100135～1451400---3000---典型花园土壤不同深度每克土壤的微生物菌落数（cfu/g）土壤生物性污染：因各种原因造成土壤中致病菌、病毒、寄生虫卵等病原微生物增多。主要来源：未经彻底无害化处理的人畜粪便和污泥用于施肥；未经处理的生活污水、医院污水和含病原体的工业废水进行农用灌溉；病畜尸体处理不当。四、土壤病原微生物及其危害病原微生物在土壤中的存活时间受土壤有机质种类和数量、pH、温度、日照、土著微生物的拮抗等因素影响。大部分较快死亡；部分可逐渐适应外界环境，较长时间存活下去。病原微生物在土壤中的存活时间的长短，与病原微生物造成疾病传播的可能性有密切关系。1、土壤中的病原微生物病原微生物存活时间粪链球菌26～77天沙门菌15～280天志贺菌1～3个月结核分枝杆菌＞180天霍乱弧菌8～60天鼠疫耶尔森菌约1年布鲁菌180天土拉热弗朗西斯菌7～150天单核细胞增生李斯特菌18～300天钩端螺旋体15～43天炭疽芽孢杆菌15～60年破伤风梭菌数年溶组织内阿米巴6～8天肠道病毒8～170天病原微生物在土壤中生存的时间人--土壤--人：人体排出的病原微生物直接由施肥和污水灌溉等污染土壤，人直接接触土壤或生吃该土壤上种植的瓜果蔬菜而感染。动物--土壤--人：有病动物排出的病原微生物污染土壤，人与污染土壤直接接触而感染发病。土壤--人：自然土壤中存在致病菌，人与污染土壤接触而得病。2、病原微生物污染土壤的途径和危害土壤微生物是参与生物地球化学物质循环和能量流动的主要成员。在土壤修复和净化方面发挥重要作用。外来致病微生物在疾病传播中起一定作用。土壤中隐藏大量的条件致病菌。五、土壤微生物的卫生学意义第三节土壤微生物的检测

与卫生标准样品采集样品的稀释检验项目与检验方法一、土壤微生物的检测1、样品采集根据检测目的选择有代表性的采样地点。按对角交叉法取样（五点法）。取样点要分布均匀，每点采样量应大致相同。取样时，先除去地表枯枝落叶，用已灭菌的刀（铲）去除1cm左右的土壤表层，用烧灼过的勺（铲）取200-300g土样装于灭菌容器内。标明采样地点、深度、日期。样品采出后尽快检验。2、样品的稀释四分法：将5点样取出（约1-1.5kg），混合，摊成薄层分成四等份，取对角线部分土壤混合，继续四分法，最后取50-100g土壤。研磨均匀，称取50g，加入450ml无菌自来水，混匀，静置5-10分钟，取上清作为原液。原液1ml含相当于土壤0.1g。作10倍系列稀释。取原液10ml，加90ml灭菌水。3、检验项目和检验方法菌落总数的测定：常规倾注培养计数。此项检测的卫生学意义不大。大肠菌群的检验：原液、10-1、10-2

、10-3

稀释液各1ml，分别注入装有10ml乳糖发酵管的培养基，采用发酵法进行。根据有大肠菌群存在的阳性管数查大肠菌群最可能数表，得到每1000g土壤中大肠菌群数。3、检验项目和检验方法大肠菌群值：能检出一个大肠菌菌群细菌所需的最少土样量。以g表示。大肠菌群值=1000/大肠菌群数大肠菌群数越大，粪源污染越严重；大肠菌群值越大，土壤越干净，粪源污染越轻。37℃，“总大肠菌群”；44.5℃，“粪大肠菌群”。接种土壤样品总量（g）每1000g土壤中大肠菌群数大肠菌群值（g）0.10.010.0010.0001————＜9000＞0.111———+90000.111——+—90000.111—+——95000.105——++180000.056—+—+190000.053—++—220000.046+———230000.043—+++280000.036+——+920000.011+—+—940000.010+—++1800000.006++——2300000.004++—+9600000.001+++—23800000.0004++++＞2380000＜0.0004大肠菌群检验数表接种土壤样品总量0.1111g（原液、10-1、10-2

、10-3

稀释液各1ml

）3、检验项目和检验方法产气荚膜梭菌的检验：土壤稀释液置80℃水浴15min，杀死繁殖体；原液、10-1、10-2、10-3稀释液各1ml，加入含亚硫酸盐和铁盐的高层培养基内，震荡混匀，经冷水迅速凝固，44℃培养24-48h。阳性结果：培养基出现裂痕、浑浊、变黑；黑色菌落镜检，G+粗短杆菌、芽孢位于次级端且小于菌体。土壤粪源污染时间判断：产气荚膜梭菌多，而大肠菌群少，表示土壤并非新近污染。3、检验项目和检验方法土壤中致病菌和病毒的检测：数量少，检出较困难。需加大检样量、浓缩样品、选择性增菌，提高检出率。目前我国尚未颁布土壤微生物卫生标准必要时参考国外标准二、土壤微生物的卫生标准卫生状况大肠菌群值（g）产气荚膜梭菌值（g）严重污染＜0.001＜0.0001中度污染0.01～0.0010.001～0.0001轻度污染1.0～0.010.1～0.001洁净＞1.0＞0.1土壤卫生状况评价指标第四节土壤微生物污染的预防土壤微生物污染的预防人畜粪便、动物尸体、污水、污泥、垃圾和医院废弃物，排放前必须进行无害化处理：化粪池、污水处理厂沼气发酵、堆肥焚烧、填埋消毒………项目卫生标准堆肥温度最高堆肥温度高达50～55℃以上，持续5～7天蛔虫卵死亡率95%～100%粪大肠菌群值0.1～0.01g苍蝇有效控制苍蝇孳生，堆肥周围没有活蛆、蛹或新羽化成蝇堆肥的卫生标准项目卫生标准密封贮存期30天以上高温沼气发酵温度53℃±2℃持续2天寄生虫卵沉降率95%以上血吸虫卵和钩虫卵在使用粪液中不得检出活的血吸虫卵和钩虫卵分大肠菌群值常温沼气发酵大于0.0001g，高温沼气发酵0.1～0.01蚊子、苍蝇有效控制苍蝇孳生，堆肥周围没有活蛆、蛹或成蝇沼气池粪渣需经无害化处理后方可用作农肥沼气发酵的卫生标准第五节土壤微生物研究的前景土壤微生物研究的前景微生物资源的开发利用：未培养微生物资源的利用创建和丰富新的环境生物技术：土壤生物修复土壤微生物生态学研究制定适合我国国情的土壤微生物卫生标准第三军医大学环境卫生学教研室《卫生微生物学》第九章空气微生物预防、检验5年制本科2007级陈济安讲师授课内容攻关的任务、考核目标及主要技术经济指标第三军医大学环境卫生学教研室空气生境特征空气微生物的来源、种类、分布及其卫生学意义空气微生物的检测与卫生标准空气微生物污染及其预防空气微生物研究的前景（重点）第一节空气生境特性37空气生境特性电离层平流层：

空气稀薄，只有水平流动；含臭氧层。对流层：

含空气、水蒸气、烟尘、微生物等。空气垂直、水平流动；有气象现象。空气中缺乏微生物生长的营养物质和水分。空气的物理化学参数不适合微生物生存和生长。气温随高度增加而降低，至对流层顶部温度低于大多数微生物能够生长的最低温度。高度↑，气压↓，不利于渗透压的维持。干燥、日光辐射、大气污染物不利于微生物生长。空气生境特性空气不是微生物栖息的场所，空气中无固定的微生物从，空气中的微生物是暂时的、可变的。△第二节

空气微生物的来源、种类、分布及其卫生学意义40自然界：主要来源，土壤、水、腐烂物等植物：某些细菌、真菌孢子动物：动物带菌和排菌量可能比人类更大人体：皮肤、毛发、口鼻、排泄物或分泌物生产活动：工业、农业、畜牧业其他：牙科、空调加湿器、微生物实验室一、空气微生物的来源细菌：绝大多数。G+球菌占多数（>80%）致病菌：结核分枝杆菌、白喉杆菌、炭疽芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、百日咳杆菌、鼠疫杆菌、嗜肺军团菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、脑膜炎奈瑟球菌等。真菌：重要组成部分。4万多种。链格、孢属、曲霉属、青霉属、枝孢霉属、酵母属、镰刀菌属。曲霉属引起“蔗渣工人肺”和“农民肺”病毒及其他微生物流感病毒，鼻病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、麻疹病毒等肺炎支原体、Q热立克次体二、空气微生物的种类高度分布：微生物在空气中的浓度与距离地面的高度呈对数下降。水平分布：城市细菌浓度高于农村，乡村的霉菌、花粉、植物孢子浓度高于城市。时间分布：早晚多，中午（12-14点）少。三、空气微生物的分布闹市区不同高度细菌数量变化高度(M)平均菌落数G+芽胞菌G+球菌其它菌数％数％数％419563.116484.1189.3815795.712479.02515.8111541711.011776.01912.3336146.64878.7914.8747222.86286.01013.9

Bovallius等研究瑞典四个功能地区发现：海岸地区63（0-560）CFU/m3

农业地区99（2-3400）CFU/m3

市内地区763（100-2500）CFU/m3

城市街道850（100-4000）CFU/m3上海地区各场所空气中细菌分布地区菌落数(每皿)人群密度（个/10m3）地区菌落数(每皿)人群密度（个/10m3）中百一店466.22.6电影院162.61.0繁忙交通点428.0--一般交通点96.0--儿科候诊室314.05.2成人候诊室115.81.5舞厅85.00.8宿舍44.90.9公园39.6--郊区17.6--正常情况下，对自然界氧、碳、硫、磷的循环起着重要作用。空气微生物污染对人类健康、工业、农业、畜牧业等都会造成影响。呼吸道传染病，伤口感染变态反应污染食品……四、空气微生物的卫生学意义第三节

空气微生物的检测

与卫生标准48自然沉降法惯性撞击式采样法液体撞击式采样器固体撞击式采样器：单级、多级过滤阻留式采样器静电沉着类采样器一、空气微生物的检测1.自然沉降法：

空气中微生物粒子在自身重力作用下，以垂直的自然方式沉降到琼脂培养基上。于37℃条件下培养24hr，计算菌落数。以cfu/皿或cfu/m3表示。一、空气微生物的检测cfu：colonyformingunit，菌落形成单位（1）自然沉降法的操作步骤制作采样皿：预培养24hr采样点选择：室内：一般为四角和中央，距墙30cm,距地面1m左右室外：综合污染、地理、气象等因素，在关键位置布点，高度在人呼吸带（1.5m）以上暴露时间：采样皿中菌落数适当，常用5min培养计数：采样后标记，细菌样品在37℃培养24hr依据：原苏联奥梅梁斯基认为，在100cm2培养基表面上，5min内能落上约10L空气所含的菌数。计算公式：

C=50000N/A·tC—细菌浓度（cfu/m3）A—采样面积（cm2）t--暴露时间（min）N—平皿上的菌落数（2）自然沉降法的计算直径为9cm的培养皿，采样5min，培养得到菌落数为10cfu，计算：C=50000*10/[(3.14*4.52)*5]=1572cfu/m3优点：简单方便脏环境采样效率较好缺点：采样效率普遍低于采样器法不适用于在有气流环境中使用不适宜检测小的带菌粒子（3）自然沉降法的优缺点2.惯性撞击式采样法：

利用抽气装置在单位时间内将一定容量的含有微生物粒子的空气，通过某些装置形成高速气流，气流中的微生物粒子随之高速运动，当气流改变方向时，运动的粒子因惯性继续向前撞击并粘集于培养基表面上。一、空气微生物的检测（1）液体撞击式采样器使气流以足够线速度冲击并被捕获在采样器液体中，菌团粒子在冲击中可被打碎成单个菌体，测定的细菌数量较准确，结果能反映出空气中含活菌粒子数。缺点：气温5℃以下喷嘴易冻结采样液量较多而接种量较少，常需滤膜进一步浓缩。不适宜多点多次采样，因每采一次需要事先在无菌条件下准备好加采样液的采样器，携带不便。（2）固体撞击式采样器利用抽气装置，使空气通过狭小的喷嘴，形成高速气流，在离开喷嘴时气流射向采集面，气体沿采集面拐弯而去，而颗粒则按惯性继续直线前进，撞击并粘附于采集面上，从而被捕获。使用方便、采样效率高，可用于定量测定，是目前应用最广泛的一类采样器。按撞击方式分为筛孔式和狭缝式。筛孔式，通过大量微细孔眼而撞击采集面，微生物粒子能均匀分布于整个采集面上；狭缝式，气流通过狭缝撞击在采集面对应的一条线上，为避免粒子重叠，采样皿需旋转。（2）固体撞击式采样器单级固体撞击式采样器：JWL型采样器为代表。将空气中不同大小的含菌粒子撞击于一个采集面上，只能测定空气中微生物的浓度。多级固体撞击式采样器：Anderson采样器为代表。将空气中不同大小的含菌颗粒采集于不同采集面，既可测定空气微生物的浓度，又可了解粒子大小分布情况。3.过滤阻留式采样器：

利用抽气装置，使空气通过滤材，而使微生物粒子阻留在滤材上。优点：可在各种气温下应用，采集效率高。缺点：阻留在滤材上的微生物受到通过滤材气流的不断冲击，有可能被吹干致死，且滤膜孔易堵塞，难以保持稳定的采气量。一、空气微生物的检测4.静电沉着类采样器：

利用高压静电场，使空气中的微生物粒子带上一定量的电荷后，被带相反电荷的采集面所吸附，使空气微生物采集下来。这种采样器对气流的阻力很小，能允许较大的采气量，可将大量空气中采集的微生物浓缩于少量的采样液中，有利于对空气含量很少的微生物的检测。一、空气微生物的检测选用采样方法应考虑的因素：

（1）采样器的灵敏度（2）采样效率（3）重复性（4）微生物存活率（5）使用方便（6）易于分析（7）可区分粒子大小（8）价格一、空气微生物的检测一、空气微生物的检测一般情况下，可选单级固体撞击式采样器。多级固体撞击式采样器较准确，但采样复杂，琼脂消耗较多，只在做空气微生物的颗粒大小测定时应用。在空气微生物学实验室的研究中，可选用液体撞击式采样器。自然沉降法可适用要求不高的场所。以细菌作为标准细菌选用的指标是菌落总数表示方法：cfu/皿或cfu/m3二、空气微生物的卫生标准二、空气微生物的卫生标准日本评价标准菌落总数/皿<3031～7576～300>300空气清洁度清洁普通空气轻污染严重污染二、空气微生物的卫生标准撞击法（cfu/m3）沉降法（cfu/皿）适用范围≤1000≤103~5星级宾馆、饭店≤1500≤102星级以下宾馆和非星级带空调宾馆、饭店≤2500≤30普通饭店、招待所、酒吧、茶座、咖啡厅、图书馆、博物馆、美术馆、飞机客舱≤4000≤40音乐厅、影剧院、录像厅、游戏厅、舞厅、理发店、美容院、游泳馆、体育馆、医院候诊室、候机室、旅客列车车厢、轮船客舱、饭馆（餐厅）≤7000≤75展览馆、商店、书店、候车室、侯船室我国公共场所空气细菌学标准二、空气微生物的卫生标准居室内空气卫生细菌学评价的参考指标（前苏联）夏季标准冬季标准空气评价细菌总数（cfu/m3

）绿色和溶血性链球菌（cfu/m3

）细菌总数（cfu/m3

）绿色和溶血性链球菌（cfu/m3

）清洁空气＜1500＜16＜4500＜36污染空气＞2500＞36＞7000＞124二、空气微生物的卫生标准级别撞击法（cfu/m3）适用范围I级区＜10器官移植、心血管、矫形等外科手术室保护性隔离等，灌注或配制注射液实验室II级区＜200无菌或手术室、供应室、婴儿室、中心灭菌单位术后恢复室、早产儿及产房、石膏室（如在手术室内）、重症监护病房III级区200～500一般病房、治疗室、放射室、衣帽室、小手术室浴室、按摩室、盥洗室IV级区传染病科、放射性核素室V级区卫生间、储藏室、太平间等WHO推荐的医院各部门空气细菌学标准二、空气微生物的卫生标准室内空气质量标准（GB/T18883-2002）对微生物指标的规定：菌落总数≤2500cfu/m3第四节

空气微生物的污染

及其预防70一、空气微生物污染尘埃(dust)：空气微生物的重要载体。飞沫(droplet)：微生物存在于呼吸道喷出的飞沫中。飞沫核(dropletnuclei)：小飞沫蒸发后剩下的核心。（一）传播方式一、空气微生物污染概念特性感染性对健康的影响监测与应用（二）微生物气溶胶1、概念气溶胶（aerosol）：是指固体或液体微粒在空气介质中的分散体系。被分散的物质（固体或液体）称为分散相，空气则称为分散介质。直径在0.001µm-100µm。微生物气溶胶（microbiolaerosol）：是指分散相中含有微生物粒子的气溶胶，根据微生物种类不同，可分为细菌气溶胶、真菌气溶胶、病毒气溶胶。2、特性一般气溶胶的物理特性：具有沉降、凝聚吸附、撞击、带电荷、扩散等作用。

微生物的生物特性：存活、衰亡、突变等。

3、感染性微生物气溶胶的感染性与微生物气溶胶粒子直径大小、数量、微生物在空气中的生存能力、机体免疫力等有关。当粒子直径大干5µm时，60％可受阻于鼻腔；当直径为4-5µm时，粒子被吸入，可到达支气管和次级支气管；当直径为l-4µm时，粒子大部分可直接到达肺深部(细支气管、呼吸支气管、肺泡)；当粒子直径小于1µm时，大部分停留于肺部，少部分因动力学关系又随呼气而排出。4、对健康的影响传播呼吸道传染病引起变态反应：农民肺、棉尘热、蔗渣尘肺、花粉病、尘螨过敏伤口感染食品变质（1）军团病军团菌属（Legionella）是革兰氏阴性杆菌，需氧菌，其最适宜培养温度为35℃，PH植为6.9-7.0。轻者则在体内产生血清反应重者则引起军团菌病，简称军团病:反复寒战、高热、伴头痛、肌痛、乏力，常有腹痛、呕吐、腹泻和全身衰竭，多数病人有咳嗽、胸痛，少量粘液痰，可有血痰。严重患者有呼吸困难，紫绀，甚至呼吸衰竭，神经精神症状，谵妄，定向力障碍等。（2）农民肺在生产劳动过程中因反复吸入含有高温放线菌及其孢子的霉变谷草粉尘而发生的一种外源性过敏性肺泡炎。此病急性期患者可自愈，慢性期病程迁延反复发作，可形成弥漫性肺间质纤维化，并发呼吸衰竭和肺原性心脏病。我国主要地处亚热带和温带，尤其长江和珠江流域气温高、雨量大，盛产稻米，堆积的谷草易发生霉变，适合高温放线菌的生长。如按有关发病率推测，我国南方农村中可能有数百万农民肺病患者未得到确诊和应有的治疗。预防：加强宣传教育，防止谷草霉变，接触霉变谷草