微生物的生长及其控制

2024/2/71第一节

微生物生长的研究方法微生物纯培养的分离微生物的培养方法微生物的同步生长与同步培养方法微生物生长的测定方法2024/2/72生物个体由小到大的增长，即表现为细胞组分与结构在量方面的增加

生长指生物个体数目的增加

繁殖在单细胞微生物中，生长繁殖的速度很快，而且两者始终交替进行，个体生长与繁殖的界限难以划清，因此实际上常群体生长作为衡量微生物生长的指标。群体生长的实质是包含着个体细胞生长与繁殖交替进行的过程。2024/2/73一、微生物纯培养的分离

平板划线分离法

稀释倒平板法

单孢子或单细胞分离法

利用选择性培养基分离法

纯培养：从一个单细胞微生物繁殖得到的后代。方法2024/2/74平板划线分离法

用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。2024/2/75稀释倒平板法

2024/2/76单孢子或单细胞分离法

采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养。在显微镜下使用单孢子分离器进行机械操作，挑取单孢子或单细胞进行培养。也可以采用特制的毛细管在载玻片的琼脂涂层上选取单孢子并切割下来，然后移到合适的培养基进行培养。2024/2/77选择性培养基分离法

各种微生物对不同的化学试剂、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用这些特性可配制合适某种微生物而限制其它微生物生长的选择培养基，用它来培养微生物以获得纯培养。微生物纯培养分离方法的比较分离方法应用范围平皿划线法方法简便，多用于分离细菌稀释倒平皿法即可定性，又可定量，用途广泛单细胞挑取法局限于高度专业化的科学研究利用选择培养基法适用于分离某些生理类型较特殊的微生物2024/2/78二、微生物的培养方法

氧气需要与否好氧培养厌氧培养根据物理特性固体培养液体培养固体培养液体培养试管斜面、平皿、茄瓶斜面工业生产中用麸皮、米糠等往复式或旋转式摇床台式发酵罐深层液体通气无论液体还是固体通过特殊的培养装置2024/2/79三、微生物的同步生长与同步培养方法同步培养法(synchronousculture)：是使培养物中所有微生物细胞都处于相同的生长阶段的培养方法。同步生长：以同步培养方法使群体细胞能处于同一生长阶段，并同时进行分裂的生长方式同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子，它是一种理想的材料。2024/2/710同步培养的方法诱导法：采用物理、化学因子使微生物细胞生长进行到某个阶段而停下来，使先到达该阶段的微生物细胞不能进入下一个生长阶段，以达到诱导微生物细胞同步生长的目的。温度培养基成份控制光照和黑暗交替培养诱导法2024/2/711选择法：对非分支的单细胞微生物来说，处于同一生长阶段的同步细胞，它们的体积和重量大致相等，处于不同生长阶段的细胞，体积和重量大小不等。因而可用膜过滤或密度梯度离心的方法，选择同一生长阶段的细胞。机械方法离心方法过滤分离法硝酸纤维素滤膜法2024/2/712硝酸纤维素滤膜法离心法2024/2/713四、微生物生长的测定方法(一)微生物细胞数目的检测方法1.总细胞计数法比浊法涂片计数法血球计数板法2.活菌计数法涂布平板法倒平板法2024/2/714血球计数板法:利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。涂片计数法:将已知体积的待测样品均匀涂布在载玻片的已知面积内,在显微镜下计算样品中微生物数量。缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；两种方法都是在显微镜下直接计数，故又称为直接计数法。特点是检测快速。2024/2/715比浊法：样品中由于菌体细胞对光的消散作用而呈浑浊，细胞数目越多，对光的消散作用越强，浑浊度越高。浊度可以用比色计或分光光度计测量，以光吸收值来表示。单细胞生物在一定的范围内的光吸收值的大小与液体中细胞数目及细胞物质量成正比，因而可用做溶液中总细胞的计数。检测时需用直接显微镜计数或平板活菌计数法制作标准曲线。该方法缺点是灵敏度差，优点是简便、快速、不干扰或不破坏样品。检测时可使用侧臂三角瓶在不同的培养时间重复测定样品的浊度，因而广泛地用作生长速率的测定。2024/2/716活菌计数法是通过在培养基形成的菌落来间接确定其活菌数的方法，也称平板计数法。原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落。活菌计数通常需要先将样品进行一系列稀释。方法的优点是能够测出样品中的活菌数，且灵敏度高，因而广泛的应用于生物、医药制品和检定及食品、水质的卫生检定。缺点是手续繁、时间长、影响因素多等。2024/2/717（二）微生物生长量和生理指标的测定方法1.湿重法:将微生物培养液离心，收集细胞沉淀物，然后称重。2.干重法：离心得到的细胞沉淀物置100~105℃的烘箱中干燥过夜至除去水分，然后称重。3.含氮量测定法：一般微生物细胞的含氮量比较稳定，可以用凯氏定氮法等测其总量，再乘以系数6.25即为粗蛋白含量，蛋白含量越高，说明菌体数和细胞物质量越高。4.DNA含量测定法：微生物细胞的DNA含量比较稳定，采用适当的荧光指示剂与菌体DNA作用，荧光比色或分光光度计法测DNA含量。5.其它生理指标：如测定碳、磷、RNA、ATP、DAP的含量。2024/2/718（三）丝状微生物菌丝长度测定方法1.培养基表面菌丝生长速率测定法。2.培养料中菌体速率测定法。3.单个菌丝顶端生长速率测定法。2024/2/719第二节微生物的生长微生物的生长表现在微生物的个体生长和群体生长两个水平上。作为单细胞，单个微生物的生长表现为细胞基本成分的协调合成和细胞体积的增加，细胞生长到一定时期，就分裂成为两个子细胞。微生物的个体生长反映在个体的细胞数目和每个细胞内物质含量两个方面的增加。由于微生物个体微小，个体质量和体积的变化不易观察，所以以微生物的群体作为研究对象，以微生物细胞的数量或微生物细胞质量的增加作为生长的指标。2024/2/720一、微生物的个体生长细菌：指新生的细胞长大以及最后分裂为两个子细胞的过程。酵母：表现为细胞体积的连续增加并在一定的间隔时间发生核与细胞的分裂。分为不等分裂和均等分裂。酵母菌的细胞分裂分为G1、S、G2、M四个时期。丝状真菌：其生长主要以极性的顶端生长方式进行。2024/2/721二、微生物的群体生长（一）无分支单细胞微生物的群体生长1.生长特征生长速率：单位时间内细胞数目或细胞生物量的增加。世代：一个细胞分裂成为两个细胞的间隔。代时：一个世代所需的时间。n=lgBt–lgB0/0.3012024/2/722（一）无分支单细胞微生物的群体生长曲线生长曲线：将少量纯种非丝状单细胞微生物接种到恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜的温度、通气等条件下培养，定时取样测定单位体积里的细胞数，以单位体积里的细胞数的对数为纵坐标，以培养时间为横坐标，画出的曲线。生长曲线描述了单细胞微生物在新的适宜环境条件中，生长繁殖直至衰老死亡全过程的动态变化。2024/2/723生长曲线可分：迟缓期对数期衰亡期稳定期2024/2/7241.迟缓期将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称延迟期、适应期。迟缓期的特点：分裂迟缓、代谢活跃①通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短；②利用对数生长期的细胞作为“种子”；③尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；④适当扩大接种量等方式缩短迟缓期，克服不良的影响。在工业发酵和科研中通常采取一定的措施缩短迟缓期2024/2/7252.对数期

对数生长期的细菌个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，代谢旺盛、生长迅速、代时稳定，所以是研究微生物基本代谢的良好材料。它也常在生产上用作种子，使微生物发酵的迟缓期缩短，提高经济效益。以最大的速率生长和分裂，细菌数量呈对数增加。细菌内各成分按比例有规律地增加，表现为平衡生长。2024/2/7263.稳定期由于营养物质消耗，代谢产物积累和pH等环境变化，逐步不适宜于细菌生长，导致生长速率降低直至零(即细菌分裂增加的数量等于细菌死亡数量)，结束对数生长期，进入稳定生长期。原因：获得更多的菌体物质或代谢产物采取措施：补充营养物质或取走代谢产物或改善培养条件，如对好氧菌进行通气、搅拌或振荡等。2024/2/7274.衰亡期

细菌代谢活性降低，细菌衰老并出现自溶，产生或释放出一些产物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有些革兰氏染色反应阳性菌变成阴性反应等。该时期死亡的细菌以对数方式增加，但在衰亡期的后期，由于部分细菌产生抗性也会使细菌死亡的速率降低。现象：特点：2024/2/728（二）丝状微生物微生物的群体生长曲线1.特性：丝状微生物在液体培养基中大多数情况下是以分散的沉淀物方式,形态从松散的絮状沉淀到堆积紧密的菌丝球不等.丝状微生物的生长通常以单位时间内微生物细胞的物质量（主要是干重)的变化来表示.丝状微生物在液体培养基中的生长方式在工业生产中很重要,它影响发酵过程中的通气性、生长速率、搅拌能耗和菌丝体与发酵液的分离难易等。2024/2/7292.生长曲线丝状微生物的群体生长有着与单细胞微生物类似的规律。在深层通气液体培养基中的生长曲线也显示具有迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期。2024/2/730三、连续培养与微生物的生长（一）分批培养和连续培养分批培养：将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获的培养方式。连续培养：在一定恒定的容积的流动系统中培养微生物，一方面以一定速率不断地加入新的培养基，另一方面又以相同的速率流出培养物（菌体和代谢产物），以使培养系统中的细胞数量和营养状态保持恒定。2024/2/731（二）连续培养类型连续培养类型恒浊连续培养恒化连续培养连续培养的基本原则：微生物培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物。2024/2/732(一)恒化连续培养在整个培养过程中通过控制培养基中某种营养物质的浓度基本恒定的方式，保持细菌的比生长速率恒定，使生长“不断”进行。生长速率的控制因子：一般是氨基酸、氨和铵盐等氮源，或是葡萄糖、麦芽糖等碳源或者是无机盐，生长因子等物质恒化器连续培养通常用于实验室的科研工作，尤其适用于与生长速率相关的各种理论研究。

2024/2/7332024/2/734(二)恒浊连续培养通过连续培养装置中的光电系统控制培养液中菌体浓度恒定、使细菌生长连续进行的一种培养方式。用于获得大量菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业中，但此法不适用于丝状微生物。2024/2/7352024/2/736第三节环境因素对微生物生长的影响

环境条件的改变，在一定限度内，可引起微生物形态、生理、生长、繁殖等特征的改变，或抵抗、适应环境条件方面的改变。当环境条件的变化超过一定能够界限，则导致微生物的死亡。研究环境条件与微生物之间的相互关系，有助于了解微生物在自然界的分布与作用，并可能采取有效措施，促进有益微生物的生长繁殖，限制甚至完全破坏有害微生物的生命活动。影响微生物生长的环境因素有很多，主要包括温度、pH、氧气和营养物质的组成和浓度。2024/2/737一、温度根据微生物生长的最适温度不同，可以将微生物分为嗜冷、兼性嗜冷、嗜温、嗜热和超嗜热等五种不同的类型。它们都有各自的最低、最适和最高生长温度范围。最适生长温度：某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度

微生物类型

生长温度／℃最低最适最高嗜冷微生物0以下1520兼性嗜冷微生物020-3035；嗜温微生物15-2020-4545以上嗜热微生物4555-6580超嗜热或嗜高温微生物6580-90100以上2024/2/738二、pH微生物生长过程中机体内发生的绝大多数的反应是酶促反应，而酶促反应都有一个最适pH范围，在此范围内只要条件适合，酶促反应速率最高，微生物生长速率最大，因此微生物生长也有一个最适生长的pH范围。微生物pH范围嗜酸性＜5.4嗜中性5.4~8.5嗜碱性7.0~11.52024/2/739三、氧根据氧与微生物生长的关系可将微生物分为好氧微好氧耐氧型兼性厌氧专性厌氧微生物类型最适生长的O2体积分数好氧微好氧氧的忍耐型兼性厌氧专性厌氧等于或大于20％2％一10％2％以下有氧或无氧不需要氧、有氧时死亡2024/2/7402024/2/741自由基是一种强氧化剂，它与生物大分子互相作用，可导致产生生物分子自由基，从而对机体产生损伤或突变作用，直至死亡。氧之所以对专性厌氧微生物以外的其他四种类型微生物不产生致死作用，是因为它们具有超氧物歧化酶，可催化起氧化基化合物分解，最终分解成水。氧对于好氧微生物生长虽然可以通过好氧呼吸产生更多的能量，满足机体的生长需要，但另一方面，氧对一切生物都会使其产生有毒害作用的代谢产物，如超氧基化合物与H2O2，这两种代谢产物互相作用还会产生毒性很强的自由基OH.。2024/2/742四、营养物质的组成和浓度培养基中营养物质的组成对微生物生长有很大影响，同一种微生物，在不同的氮源、碳源组成的培养基中，在相同的培养时间内其微生物的增加量可行相差很大，甚至有的不能生长。培养基中营养物质的浓度首先表现在对生长速率的影响，在微生物的培养中，某种基本营养物质被耗尽也可能使微生物的生长停止，即使此时培养基中没有任何任何毒性物质存在，而且其它营养物质仍很丰富，当添加少量珍重营养物质时则微生物的生长可以重新开始。在微生物培养中，首先被消耗完毕的营养物质被称为限制性底物（S）。限制性底物能表示出分批培养中微生物生长的最大限度。2024/2/743∪=∪max+[S]/Ks+[S]∪:微生物生长的的速率∪max：微生物生长的最大速率K：∪达到∪max一半时底物的浓度Y=Xt-X0/[S0]-[St]Y：细胞产率系数X：细胞数目S：限制性底物浓度2024/2/744第四节微生物生长的控制在微生物研究、生产实践与现实生活中，我们需要控制所不期望的微生物的生长。任何杀死或抑制微生物生长的方法都可以达到控制微生物生长的目的，他们包括加热、低温、干燥、辐射、过滤等物理方法和消毒剂、防腐剂、化学治疗等化学方法两大类。2024/2/745防腐(antisepsis)：在某些化学物质或物理因子作用下，能防止或抑制微生物生长的一种措施。消毒(disinfection)：利用某种方法杀死或灭活物质或物体中所有病原微生物的一种措施。灭菌(sterilization)：指利用某种方法杀死物体中包括芽孢在内的所有微生物的一种措施。化疗(chemotherapy)：利用具有选择毒性的化学物质如磺胺、抗生素等对生物体内部被微生物感染的组织或病变细胞进行治疗，以杀死组织内的病原微生物或病变细胞，但对机体本身无毒害作用的治疗措施。根据需要和目的，对微生物生长控制的要求和采用的方法不同，由此产生的效果也不同。2024/2/746一、物理方法的控制（一）温度高温低温干热灭菌湿热灭菌巴斯德消毒法烘箱热空气法火焰焚烧法水煮沸法高压蒸汽锅法冷藏法冷冻法2024/2/747高温灭菌原理：高温可引起蛋白质、核算和脂肪等重要生物大分子降解或空间结构改变等，从而使它们的功能丧失。衡量灭菌效果的指标十倍致死时间(decimalreductiontime)：即在一定的温度条件下，微生物数量十倍减少所需要的时间。热致死时间(thennaldeathtime)：即在一定温度下杀死所有某一浓度微生物所需要的时间。2024/2/7481.干热灭菌：通过灼烧或烘烤等方法是蛋白质变性杀死微生物。（1）烘箱热空气法：171℃，1h；160℃，2h以上；120℃，12h以上；对象：金属器械、玻璃器皿，油料或粉料。（2）灼烧法：对象：接种针、接种环或带病原菌材料、动物尸体。2024/2/7492.湿热灭菌：是利用热蒸汽灭菌，在同样的温度和相同作用时间下，效果要好于干热灭菌。因为：§湿热蒸汽穿透力强§能破坏维持蛋白质空间结构和氢健的稳定性，加速这一重要生命大分子物质的变性。§蒸汽存在潜热，当气体变为液体时可释放出大量热量，能迅速提高灭菌物体的温度。2024/2/750（2）高压蒸汽灭菌法

利用提高压力使水的沸点升高，以提高水蒸气的温度，达到更加有效的杀死微生物。高压蒸汽灭菌的温度越高，微生物死亡越快。在0.1013MPa压力下，水蒸气温度达到121.3℃，灭菌时间15~30min。

（1）煮沸消毒

将待消毒物品如注射器、金属用具、解剖用具等在水中煮沸15min或更长时间，以杀死细菌或其他微生物的营养体和少部分的芽孢或孢子。如果在水中适当加1％碳酸钠或2％一5％的石炭酸则杀菌效果更好。2024/2/751

高温对牛奶及其热敏感物质不适宜，因为高热破坏了食品的营养与风味。该法可以使食品中的微生物数量下降97%~99%，只能作为消毒而不能作为灭菌。（3）巴氏消毒法具体方法低温维持法：在63℃下维持30min高温法：在72℃下维持15s超高瞬时温法：在135-150℃下维持2-6s2024/2/752低温原理：通过降低酶反应速度使微生物生长受到抑制，但不能杀死微生物。1.冷藏法：新鲜食品放5℃保存，可以防止腐败。但贮藏只能维持几天。微生物菌种放置冷藏箱可保存数周至数月。2.冷冻法：

鲜食品放-10℃冷冻温度，微生物基本不再生长。保存菌种需要-80℃低温冰箱、-78℃干冰中或-196℃液氮中保存。2024/2/753（二）辐射(radiationSterilization)辐射灭菌是利用电磁辐射产生的电磁波杀死大多数物质上的微生物的一种有效力法。用于灭菌的电磁波有:微波:通过热产生杀死微生物的作用；紫外线(UV):使DNA分子中相邻的嘧啶形成嘧啶二聚体，抑制DNA复制与转录等功能，杀死微生物；X射线和y射线:使其他物质氧化或产生自由基(OH·、H·)破坏和改变生物大分子的结构，以抑制或杀死微生物。2024/2/754（三）干燥和渗透压通过降低微生物可利用水的数量或活度而影响微生物的生长。1.干燥：使细胞失水造成代谢停止而抑制微生物生长，有时也可引起某些微生物细胞的死亡。2.渗透压：通过限制微生物可利用水而控制其生长的方法。高渗环境中，水从细胞中流出，是细胞脱水。2024/2/755（四）过滤不耐热的液体培养基的灭菌2024/2/756二、化学方法的控制

一类能够杀死微生物或抑制微生物生长的化学物质。它们控制微生物生长的作用机理：

抑菌

杀菌

溶菌

用机理是这类物质结合到核糖体上抑制蛋白质合成，导致生长停止，由于它们同核糖体结合不紧，它们在浓度降低时又会游离出来，核糖体合成蛋白质的能力恢复，使生长恢复它们是紧紧地结合到细胞的作用靶上，即使在浓度降低时也不能游离出来，因此生长不能恢复能抑制细胞壁合成或损伤细胞质膜2024/2/757化学药剂根据作用效果又将它们分为消毒剂、防腐剂和化学治疗剂。消毒剂：可抑制或杀死微生物，通常用于非生物材料的灭菌或消毒。防腐剂：能杀死微生物或抑制其生长，但对人及动物的体表组织无毒性或毒性低，可用于机体表面或用于食品、饮品和药品的防腐。HgCl2、CuSO4、碘液、氯气、乙烯氧化物、甲醛剂、臭氧有机汞、0.1%~1％硝酸银、碘液、70%乙醇、3％过氧化氢（一）消毒剂和防腐剂2024/2/7581.醇类作用原理：蛋白质烷基化，改变酶和蛋白质的活性。对象：2%甲醛浸泡器械或10%甲醛熏蒸房屋。40%的甲醛水溶液称福尔马林。2.醛类作用原理：使膜损伤、蛋白质变性、低级醇还是脱水剂。对象：用于皮肤及器械消毒。70%的乙醇杀菌效果最好，实际工作中使用75%。2024/2/7593.酚类作用原理：低浓度酚破坏细胞膜组分、高浓度酚凝固菌体蛋白。酚还能破坏结合在膜上的氧化酶与脱氢酶。对象：0.5石炭酸皮肤消毒；2%~5%痰、粪便和器皿；5%空气喷雾。苯酚又称石炭酸，甲酚效果要强于苯酚。来苏尔是甲酚与肥皂的混合液，使用浓度3%~5%。4.表面活性剂类作用原理：破坏菌体细胞膜的结构，造成胞内物质泄露，蛋白质变性。对象：皮肤和粘膜消毒。肥皂和新秸尔灭。2024/2/7606.氧化剂类作用原理：碱性染料的阳离子与菌体的羧基或磷酸基作用，形成弱电离的化合物，妨碍菌体的正常代谢。对象：皮肤和伤口的消毒。紫药水就是2%~4%结晶紫水溶液。5.染料作用原理：作用与蛋白质巯基，使蛋白质和酶失活强氧化剂还可以破坏蛋白质的氨基和酚羟基。对象：皮肤和水的消毒。碘酒就是5%碘+10%碘化钾的混合液；漂白粉。2024/2/7617.重金属类作用原理：使蛋白质变性。对象：食用菌、植物组织分离外表面消毒、器皿的消毒。2%红汞的水溶液就是红药水，硫酸铜、硫酸铜与石灰的混合液称为波尔多液。8.酸碱类作用原理：极端酸碱条件可使蛋白质变性。对象：排泄物、地面消毒、食品、饮料防腐。石灰、苯甲酸、山梨酸、丙酸。2024/2/762各种化学消毒剂杀菌能力的比较方法石炭酸系数：指在一定时间内被试药剂能杀死全部供试菌的最高稀释度和达到同效的石炭酸的最高稀释度的比率。一般规定处理时间为10分钟，而供试菌定为Salmonellatyphi（伤寒沙门氏菌）。在临床上最早使用的消毒剂----石炭酸2024/2/763（二）化学治疗剂指能够特异性地作用于某些微生物并具有选择性毒性化学药剂，他们与非特异性的化学药剂相比对人体几乎没有毒性或毒性很小，可用作治疗微生物引起的疾病。化学治疗剂根据来源分为两大类，一类是人工合成的，主要是一些生长因子类似物，被称为合成药；另一类是微生物产生的，被称为抗生素。2024/2/7641.生长因子类似物在结构上与微生物的生长因子相似但又有区别，它们不能够在菌体细胞内起着生长因子的同样作用，但却能够组织微生物对生长因子的利用，从而抑制微生物的生长。叶酸对抗物（磺胺）、嘌呤对抗物（6-巯基嘌呤