SNT5665-2023 鲁氏耶尔森氏菌检测技术规范

S中华人民共和国出入境检验检疫行业标T鲁氏耶尔森氏菌检测技术规9发 1实中华人民共和国海关总署发布T 本文件按标准化工作导则第1部分标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位中华人民共和国深圳海关动植物检验检疫技术中心中华人民共和国黄埔海关技术中心中华人民共和国福州海关中华人民共和国天津海关中华人民共和国武汉海关华中农业大学。本文件主要起草人王津津陈兵陈进会吴江刘荭王乃福史秀杰于力杨俊兴郑晓聪、王武军陈孝宇任向阳麦晨秦智锋。ⅠT鲁氏耶尔森氏菌检测技术规范围本文件描述了鱼类鲁氏耶尔森氏菌的分离培养聚合酶链式反应和生化鉴定方法。本文件适应于鱼类鲁氏耶尔森氏菌的实验室检测。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中注日期的引用文件仅该日期对应的版本适用于本文件不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改单适用于本文件。分析实验室用水规格和试验方出入境动物检疫采术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义缩略语下列缩略语适用于本文件脑心浸出液琼脂DNA:脱氧核糖核酸脱氧核糖核苷酸三磷酸溴化乙锭m磷酸盐缓冲液聚合酶链式反应胰蛋白胨大豆琼脂。概述鲁氏耶尔森氏菌属于肠杆菌科耶尔森氏菌属是一种能够引起水生动物特别是冷水鱼类和温水鲤科鱼类发生肠炎红嘴病的条件性致病菌。由该菌引起的疾病的临床症状流行病学等见附录。试剂和材料胰蛋白胨大豆琼脂见附录B中脑心浸出液琼脂见1T氧化酶试剂见革兰氏染色液见磷酸盐缓冲液见商品化的生化鉴定试剂盒水用于包括核酸抽提DEPC处理DNARNA酶。其余用水应符合2一级水的规格酶20℃保存避免冻融或温度剧烈变化;;扩增片段大小仪器和设备剪刀和镊子培养皿恒温培养箱普通冰箱和超低温冰箱显微镜离心机和离心管微量移液器及吸头电泳仪或全自动毛细管电泳仪紫外观察灯或凝胶成像仪全自动微生物鉴定系统组织匀浆机或无菌研钵生物安全柜恒温水浴锅涡旋振荡器样品处理采样8的规定采样。无临床症状的鱼无菌采集其肾肝脾等对于体表有临床症状的鱼可采取其病灶深处的组织处理用于分离培养的样品直接将采集的组织用无菌接种环接种培养基用于PCR检测的样品将采集的组织置于无菌离心管中加入5使用组织匀浆机充分匀浆12如无组织匀浆机则将样品放入无菌研钵中充分研磨然后将制2T备好的组织悬液在4离心10取上清液转入另一无菌离心管中备用核酸检测方法核酸抽提将处理好的组织样品或者疑似为鲁氏耶尔森氏菌的细菌分离物加到含有20μL蛋白K()和L缓冲液见的5L离心管中上下颠倒混匀将匀浆液置于56℃水浴水浴1h~3h;向匀浆液中按1∶1比例加入酚/三氯甲烷/异戊醇混合液见上下颠倒混匀g离心5转移上层水相加入等体积三氯甲烷/异戊醇混合液见上下颠倒混匀g离心5转移上ng上清液于沉淀中加入5%乙醇溶液轻轻混匀后离心5倾去上清液室温晾干;用30μL灭菌双蒸水溶DNA沉淀冰上保存备用。若需长期保存应放置在-20保存。也可使用等效的商品化试剂盒抽提核酸R5LLq0LL120210延伸54℃保温电泳用E电泳缓冲液见配制%%的琼脂糖凝胶含L见。将凝胶放入水平电泳槽使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将L样品和溴酚蓝指示剂溶液按比例混匀后加入样品孔。在电泳时使用核酸分子质量标准参照物作对照5m电泳约当溴酚蓝到达底部时停止。在凝胶成像仪或紫外投射灯下观察有无A带并判定结果。也可使用全自动毛细管电泳仪进行电泳测序和分析对扩增产物进行序列测定测序结果与k中的序列进行比对按附录结果判定将标准菌株的核酸设立为阳性对照空白对照阴性对照均成立视为反应结果符合R无扩增或扩增片段大小不符合判定为鲁氏耶尔森氏菌阴性。若扩增处出现p阳性扩增带且扩增产物的序列与k中鲁氏耶尔森氏菌的序列相似度%则需要按照第0章中所述进行细菌分离和细菌初步鉴定将符合3判定的疑似鲁氏耶尔森氏菌进行进一步的细菌R鉴定或生化鉴定确定。细菌分离和培养℃5形态为圆形隆起表面光滑边缘整齐有光泽的乳白色半透明菌落直径2mm~3mm。3T细菌初步鉴定革兰氏染色将可疑菌落涂片进行革兰氏染色镜检观察。如观察到红色短杆状细菌表明为革兰氏阴性菌氧化酶试验在一载玻片上放一块滤纸片然后用一滴蒸馏水湿润纸片再用接种环取单个菌落于上述湿的纸片上最后在其上加一滴氧化酶试剂。若在12n不变色表明该菌氧化酶阴性。结果判定革兰氏染色阴性氧化酶试验阴性菌体呈微弯曲的短杆状细菌可判定为疑似鲁氏耶尔森氏菌需做细菌R鉴定或生化鉴定确定。细菌分离物生化鉴定对上述疑似鲁氏耶尔森氏菌进一步做生化鉴定鉴定结果见表。也可采用商品化的生化鉴定试剂盒按其说明书要求进行操作或采用全自动微生物鉴定系统进行鉴定。表1鲁氏耶尔森氏菌生化特性生化反结果生化反结果半乳糖+肌醇-精氨-山梨-赖氨酸脱羧+鼠李-鸟氨酸脱羧+蔗糖-柠檬-蜜二--苦杏仁-尿素-阿拉伯-色氨酸脱氨-氧化-吲哚产-硝酸盐还-P反应++明胶-麦康凯培养基生+葡萄++甘露+—综合判定组织样品经PCR检测为阳性且经过细菌分离培养进一步生化鉴定或者细菌PCR鉴定结果4T为阳性的判定为鲁氏耶尔森氏菌检测阳性分离菌经初步鉴定为疑似鲁氏耶尔森氏菌经进一步生化鉴定或者细菌PCR鉴定结果为阳性的判定为鲁氏耶尔森氏菌检测阳性。组织样品经PCR检测为阴性或未分离到细菌或所分离到细菌的生化鉴定结果不符合鲁氏耶尔森氏菌特性的均判定为鲁氏耶尔森氏菌阴性。5T附录资料性鲁氏耶尔森氏菌简病原鲁氏耶尔森氏菌是革兰氏阴性肠杆菌该菌为微弯曲大小在×的杆菌靠7根~8根周鞭毛运动5℃培养有动力7℃培养无动力。在胰蛋白胨大豆琼脂或脑心浸出液琼脂培养基上于25℃培养48h~72h可形成圆形隆起表面光滑边缘整齐有光泽的乳白色半透明菌落直径2mm~3mm。危害6年首次报道该病原菌分离自美国爱达荷州哈格曼山谷的患病虹鳟s。目前在北美洲南美洲欧洲澳大利亚南非中东地区和中国等地都有报道。鲁氏耶尔森氏菌可感染多种鱼类对鲑科鱼类影响特别明显是造成鲑科鱼类肠炎红嘴病M的主要病原菌。临床症状被感染的鱼可以观察到异常的行为变化包括在水面附近游动食欲不振和异常游动如竖游旋游倒游等患病鱼还表现出其他体征如眼球突出皮肤变黑口腔和咽喉及其周围皮下出血肛门红肿有异物流出等。鲁氏耶尔森氏菌侵染初期出现患病典型症状的鱼较少感染后短时间内疾病大规模暴发死亡严重。地理分布在北美洲南美洲欧洲澳大利亚南非中东地区和中国等地均有分布易感宿主鲁氏耶尔森氏菌可感染多种鱼类鲑科鱼类影响特别明显。除了鲑鱼以外鳗鱼a-鲤鱼鲟鱼鲶鱼s等也能被感染。6T附录B规范性)试剂配制胰蛋白胨大豆琼脂胰蛋白胨大豆琼 蒸馏 0溶解胰蛋白胨大豆琼脂到蒸馏水中1高压灭菌5水浴冷却50℃倒成平板大约厚4保存脑心浸出液琼脂脑心浸出液琼 蒸馏 0溶解脑心浸出液琼脂到蒸馏水中1℃高压灭菌15水浴冷却50,倒成平板大约3厚4保存氧化酶试剂四甲基对苯二 蒸馏 0将四甲基对苯二胺溶于蒸馏水中2℃~5℃冰箱避光保存在7d内使用注:也能使用等效的商品化的氧化酶试纸条革兰氏染色结晶紫染色液结晶 % 01%草酸铵水溶 0将结晶紫完全溶解于乙醇中然后与草酸铵溶液混合革兰氏碘液 碘化 蒸馏 0将碘与碘化钾先进行混合加入蒸馏水少许充分振摇待完全溶解后再加蒸馏水至mL沙黄复染液沙 % 0蒸馏 0将沙黄溶解于乙醇中然后用蒸馏水稀释7T染色法涂片用火焰固定后滴加结晶紫染液作用1水洗。滴加革兰氏碘液作用1水洗。滴加5%乙醇脱色直至染色液被洗掉不要过分脱色水洗。滴加复染液复染1水洗待干镜检。磷酸盐缓冲液氯化 氯化 磷酸氢二 磷酸二氢 无e超纯 将固体物质溶解于水如果有必要5℃时调节pH至1℃高压灭菌15冷却备用 蛋白酶工作液)E 0mL 10g0L的工作液消化缓冲液L0LH1LH%质量