植物基因组DNA的提取

一、实验目的通过采用改进的SDS法提取植物叶片基因组DNA，使学生学习和掌握从植物组织中提取DNA的方法和原理。二、实验原理基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交、RFLP、PCR分离基因和分子标记分析等。利用基因组DNA序列较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，大分子的基因组DNA形成沉淀，而小分子DNA则附于管壁及管底,通过离心方法即可将它们分离，从而达到提取的目的。在提取过程中，若操控不当，基因组DNA会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓等，以保证得到较完整的基因组DNA。一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb以上，否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析,DNA长度可短至50kb,在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下)，并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同;不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时可参照文献和经验建立相应的实验方法,以获得可用的DNA大分子。组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时,应考虑除去多糖和酚类物质。三、实验仪器和材料台式高速离心机恒温水浴陶瓷研钵1.5ml离心管移液器无菌枪头无菌牙签液氮吸水纸四、实验试剂DNA提取洗涤液100mmol／LTris•HCl(pH8.0)，3％可溶性PVP，20mmol／L巯基乙醇，20mmol／LEDTA(pH8.0))DNA裂解液(100mmol／LTris•HCl(pH8.0)，20mmol／LEDTA(pH8.0)，500mmol／LNaC1，1.5％SDS)酚/氯仿/异戊醇(v:v:v=25:24:1)5MKAc无水乙醇异丙醇70%乙醇含5g/mlRNase的TE缓冲液五、基本操作与仪器介绍1、琼脂糖凝胶电泳技术琼脂糖凝胶电泳是重组DNA研究中常用的技术，可用于分离，鉴定和纯化DNA片段。不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。凝胶中的DNA可与荧光染料溴化乙锭（EB）或其它染料结合，在紫外灯下可看到荧光条带，籍此分析实验结果。操作步骤如下：水平放置凝胶成形模具，插上梳子。称取DNA电泳用琼脂糖0.6g放入250ml的三角烧杯中，加入50ml0.5×TBE缓冲液，摇匀后将烧瓶置于微波炉中，加热煮沸，直至琼脂糖完全溶解。关闭电炉，取出三角烧瓶，将其置室温下冷却至70℃左右（手握烧瓶可以耐受），再加入3μL荧光染料，混匀后，即将凝胶溶液倒入胶板铺板。室温下待凝胶完全凝固（需时约30-60min），轻轻拔出梳子，将胶板放入电泳槽中。电泳槽中加入0.5×TBE缓冲液，以高出凝胶表面2mm为宜。吸取经溴酚兰染色的样品，加入点样孔中。接通电源，调节电压至100伏，待溴酚兰条带距凝胶前端2cm时关闭电源。将凝胶板取出，在紫外灯下观察结果、记录数据和拍照。注：影响DAN片段琼脂糖电泳的几个因素：（1）DNA分子的大小：线性DNA分子的迁移率与其分子量的对数值成反比。（2）琼脂糖浓度：一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率是不相同的。相反，在一定浓度的琼脂糖凝胶中，不同大小的DNA片段的迁移率也是不同的。若要有效地分离不同大小的DNA，应采用适当浓度的琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶浓度可分辨的线性DNA片段（kb）0.45-600.70.8-101.00.4-61.50.2-41.750.2-32.00.1-3（3）DNA分子的形态：在同一浓度的琼脂糖凝胶中，超螺旋DNA分子迁移率比线性DNA分子快，线性DNA分子比开环DNA分子快。（4）电流强度：每厘米凝胶电压不超过5V，若电压过高分辨率会降低，只有在低电压时，线性DNA分子的电泳迁移率与所用电压成正比。2、移液枪的使用（1）吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，绝不允许突然松开，以防溶液吸入过快而冲入取液器内腐蚀柱塞而造成漏气。（2）为获得较高的精度，吸头需预先吸取一次样品溶液，然后再正式移液，因为吸取血清蛋白质溶液或有机溶剂时，吸头内壁会残留一层“液膜”，造成排液量偏小而产生误差。（3）浓度和粘度大的液体，会产生误差，为消除其误差的补偿量，可由试验确定，补偿量可用调节旋钮改变读数窗的读数来进行设定。（4）可用分析天平称量所取纯水的重量并进行计算的方法，来校正取液器，1ml蒸馏水20℃时重0.9982g。（5）使用时避免倒转移液器，避免液体进入枪体内。使用完后，及时将枪头移除置烧杯中，将移液枪挂在移液枪架上，切不可平放。（6）不可使用对枪体有腐蚀性的液体。3、数码凝胶成像系统的使用（1）根据需求选择不同的底座（蛋白摄像需采用白光底座，核酸摄像需采用紫外底座）。（2）打开所有仪器的电源。（3）打开电脑操作系统，双击GIS进入图像处理系统。（4）打开暗箱，放入凝胶。（5）打开白光光源，调整凝胶位置，调节焦距，调节凝胶放大倍数。（6）关闭白光灯源，打开紫外光源，可见EB荧光谱带，可通过“增大”和“变小”功能调节光圈，用“聚焦”和“散焦”调节聚焦能力，或上下拉动下方的亮度和对比度标尺进行调节图像清晰。（7）调节好亮度和对比度后，单击“拍摄”，拉动标尺调节曝光时间，单击小对话框的拍摄照相，然后单击“退出”完成拍摄同时关闭紫外光源。保存图像。（8）关闭成像系统。（9）取出凝胶，清理箱体。（10）进行图片处理与标记，打印图片（图片剪下后，贴到报告纸上）。六、实验步骤取指甲大小的植物叶片，置于研钵中，加入适量液氮，用研棒磨成粉未（越细越好）。将粉末移入1.5ml离心管，加入DNA提取洗涤液1.5ml，轻轻颠倒混匀。8000rpm离心10min，弃上清，加入洗涤液1ml，混匀，8000rpm离心10min，弃上清，共洗涤2遍。加入预热的DNA裂解液500μL，用牙签轻轻搅拌均匀，置65℃水浴30min。水浴后立即加入苯酚/氯仿/异戊醇500μL，颠倒数次，这时溶液变为乳白色，10000rpm离心5min，取上清液至新的1.5ml离心管中。加入55μL醋酸钾，颠倒混匀，10000rpm离心10min，取上层清液转移至新的1.5ml离心管中。加入异丙醇300μL，室温30min或-20℃放置2hr，12000rpm离心10min，弃上清，取沉淀，加入500μL70%乙醇，室温放置2min，12000rpm离心5min，弃上清，取沉淀。加入30μL含5g/mlRNase的TE缓冲液，37℃水浴放置1hr。离心30s后，取10μL于0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳鉴定。七、结果分析完整性好的基因组DNA应是一条比23Kb滞后的电泳带，若降解则成为弥散状，电泳前缘为未除干净的RNA。如果DNA沉淀呈白色透明状而且溶解后成粘稠状，说明DNA含有较多的多糖类物质，可以在取材前将植物放暗处24hr，以达到去除淀粉的目的。DNA沉淀呈棕色。植物材料含有大量酚类化合物，与DNA共价结合，使DNA呈棕色，并可抑制DNA的酶解反应。为防止此情况出现，可加入2-5%的巯基乙醇，或者加入亚精胺(100μLDNA加5μL

0.1mol/L的亚精胺）。DNA中含有多糖或盐类。将DNA用100%乙醇或异丙醇沉淀出来，离心，沉淀用70%乙醇清洗两次或更多次，吹干后重溶于TE中。（注意乙醇一定要吹干，否则电泳点样时，样品上漂）DNA已降解电泳条带呈弥散状。样品降解可能有两种情况：一是机械振动过剧烈，二是操作过程中DNase污染。在提取DNA的各个操作过程中要避免剧烈振荡，提取液及用品要高温高压灭菌。另外，避免反复冻融DNA。实验注意事项注意移液枪的使用规范，爱护好每一把移液枪。注意数码凝胶成像系统的规