酶与酶工程课件

抗体酶

Abzyme一概述二机制三制备四应用

1946年,诺贝尔奖二次得主美国化学家LinusPauling提出酶催化反应的过渡态理论：酶催化化学反应的机制在于：酶能与高能、短寿命的过渡态（激发态）相结合，在这个处于反应底物和产物之间的过渡态构型中，某些键断裂而另一些键形成，从而大大降低了化学反应的活化能。

一、抗体酶的发现与研究思路

酶的催化机理是降低活化能

能与过渡态结合的抗体也具有酶的性质

根据Pauling理论，WilliamJencks于1969年预言：若能找到对应某反应过渡态的抗体，将其加入该反应体系中，就可观测到这个抗体对该反应的催化效应。也即：抗体若能与某化学反应的过渡态结合，则这样的抗体必也能像酶一样，使其活化能降低，从而帮助大量反应物分子跨越能障，达到加速反应的目的。这就意味着，抗体一旦能与过渡态相结合，它就具有酶的性质，即在温和条件下高效专属地催化学反应。

LinusCarlPauling

寻找过渡态类似物作为半抗原产生的抗体可能具有酶活性

由于ES‡过渡态中间物的半衰期很短，实践中很难获得反应的过渡态，若设计和制备稳定的过渡态类似物（能够模拟一个酶催化反应过渡态的结构的稳定物质，它能与相应的酶紧密结合而成为该酶的竞争性抑制剂），以此替代反应的过渡态作为半抗原，诱导与其互补构像的抗体，这样产生的抗体就能识别反应过程的真正过渡态，该抗体即有酶催化反应的基本特征，可能成为一种具有酶活性的抗体。

如愿以偿

在1986年，加利福尼亚实验室的Lerner和Schultz同时报道了成功制备具有催化能力的单克隆抗体---催化抗体，证实了抗体和酶一样，能专一催化化学反应的事实。此后，抗体酶才从理论变为了现实。

目前，抗体酶的研究方向是如何提高酶的效率以及免疫学中的应用。

PeterSchultzAquestion:

抗体酶是酶还是抗体？

二、抗体酶的结构与机制

什么是酶(enzyme)？酶——活细胞产生，起生物化学反应催化剂作用的蛋白质。

什么是抗体（antibody，Ab）？抗体——是B细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生的一种蛋白质，主要存在于血清等体液中,能与相应抗原特异性地结合，具有免疫功能。

其本质是一类免疫球蛋白。

抗体结构

抗体分子是由两条轻链(lightchain,L链)和两条重链(heavychain,H链)通过链间二硫键连接而成的四肽键结构。经蛋白酶水解后分为抗原结合片段(antigenbindingfragment,Fab)

和可结晶片段(crystallizabefragement,Fc)；位于H和L链的N-端的可变区是抗原的结合位点,由约110个氨基酸构成(variableregion,V)。其中H链含4个超变区段，L链含3个超变区段，加上两条链的组合，就可产生108以上种抗体分子。

抗体酶模型

抗体酶——Abzyme

是酶的高效催化能力和抗体的高度选择性巧妙结的产物，本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋（Ig），在其可变区赋予了酶的属性。因此，催化抗体又称抗体酶。通过一系列化学和生物技术方法制备出具有催化活性的抗体，除了具有相应的免疫学性质，还类似于酶，具有各种催化特性。所以，其实抗体酶是一种特殊的抗体，它有着催化特性，可谓是酶和抗体性质的兼得。所以又被称为催化抗体。（Catalyticantibody）

抗体酶的作用机制

酶和抗体的本质差别在于：酶是能和反应过渡态

(激发态分子)选择结合的催化物质。而抗体是和基态分子选择结合的催化物质,它们识别底物的机理是相同的。如果以激发态的分子为半抗原激发免疫系统产生抗体,那么这种抗体就可能像酶一样催化经过此过渡态的化学反应。由于在实践中很难获得反应的过渡态，激发态的过渡态分子不可能作为抗原来产生抗体，所以对某一特定的酶催化的化学反应,可以合成一种稳定态分子,它在带电性能,几何形状与反应过渡态分子结构类似。这种稳定态分子即为过渡态类似物。

设计和制备稳定的过渡态类似物，以此代替反应的过渡态作为半抗原诱导产生抗体，这样产生的抗体就能识别反应过程的真正过渡态，该抗体具有酶催化反应的基本特征，可能成为一种具有酶活性的抗体。这就是我们所称的抗体酶。

抗体酶与天然酶相比其优势何在？（1）抗体酶可以达到专一催化某一底物转化的反应。（2）抗体酶能催化那些理论上认为非常不利的反应。（3）抗体酶能催化那些天然酶不能催化的反应。

(4)不仅提供了人工生物催化剂，而且提供了研究生物催化过程的新途径。

抗体的种类非常多，免疫系统可以拥有上亿种抗原特异性不同的抗体分子。应用抗体的种类繁多以及抗体酶的可诱导、可改造的特点，有望能制备出具有治疗和辅助治疗某些疾病和催化某类具有特殊意义反应的抗体酶。

Aquestion:

如何让抗体具有酶活性？

抗体酶制备的基本原理

按照现代酶学理论，酶首先要和底物结合，使底物向过渡态转化，然后再在催化基团的作用下促进底物进行反应。免疫反应和酶反应十分相似，抗体也能专一地、高亲和力地与抗原物质结合，然后再促使抗原发生各种变化。如果能适当地改变抗体中与抗原结合部位的微环境，并在适当部位引入相应的催化基团，那就有可能使抗体转变为具有催化性能的抗体酶。三、抗体酶的制备制备方法诱导法基因工程法拷贝法导入法修饰法

诱导法

采用过渡态的底物类似物诱导

(transitionstateanalogue)

作为酶的抑制剂的过渡态类似物是稳定的，因此利用抗体能与抗原特异结合的原理，可用过渡态的类似物作为半抗原来诱发抗体，这样产生的抗体便能特异的识别反应过程中真正的过渡态分子！

首先设计和制备过渡态的底物类似物，以它作为半

抗原（hapten），再和载体蛋白质一起免疫动物，然后

分出脾细胞，进而和骨髓瘤细胞融合，选出对半抗原有

高亲和力的克隆，使之在培养介质中生长扩增，最后选

择、纯化产生的具有催化活性的单克隆抗体。此法的关

键是要设计和获得适当的过渡态底物类似物作为半抗原。“制备”抗原：设计过渡态类似物合成半抗原半抗原－载体杂交瘤细胞制备：免疫小鼠与骨髓瘤细胞结合限制性稀释筛选与半抗原具有高亲和力的克隆制备单克隆抗体：将细胞培养于腹水液或培养介质中生产单抗纯化单抗筛选抗体酶：筛选具有催化性能的单抗

简言之——

诱导法是选择适当的化学模型物与载体蛋白连接后给动物免疫，通过杂交瘤技术筛选和分离单克隆抗体（所得抗体催化效果的好坏很大程度上取决于化学模型物的设计）。

基因工程法

对于已经获得的单抗，分析其氨基酸序列和相应基因的碱基序列，将抗原结合部位的基因换上编码有催化作用的氨基酸的基因，这就是基因工程法制备抗体酶的主要内容。基因工程的技术使得建立抗体基本的组合文库，并根据需要构建适当序列的基因片断已成为可能。利用抗体库技术，在将来也许有可能绕开免疫，产生完全由基因工程构建的全新抗体酶。

拷贝法

用已知酶作为抗原免疫动物，通过单克隆技术，制得抗该种酶的抗体。再以此种抗体免疫动物，再次采用单克隆技术，经筛选与纯化，就可获得具有原来酶活性的抗体酶(因为抗原与该抗产生的抗体具有互补性，经过上述两次拷贝，就把酶的活性部位的信息翻录到抗体酶上，使该抗体酶能高选择性地催化原酶所催化的反应)。这种方法对自然界来源稀少的紧缺酶，不失为一种有价值的有潜力的方法。

导入法在现有的抗体基础上，借助化学修饰或蛋白质工程的办法将催化基团引入到已有底物结合能力的抗体的抗原结合部位上。可以采用选择性化学修饰的方法将人工合成的或天然存在的催化基团引入到抗原结合部位；也可采用寡核苷酸定点诱变技术将特定的氨基酸残基引入抗原结合部位，使其获得催化功能。化学修饰法

抗体酶和酶一样也可以用化学修饰的方法加以改造。对抗体酶进行结构修饰的关键是找到一种温和的方法，在抗体结合位置或附近引入具有催化功能的基团。

游离巯基就是适合的基团之一,它具有高亲核性,易于氧化,及能通过二硫化物进行交换反应或亲电反应而选择性修饰的特点。Schultz等在IgAMOP315抗体结合部位选择性的引入了亲核性的巯基。其方法如下:用含有易裂解键(如二硫键或硫键)的亲和力标记试剂,在NaCNBH3存在下,对抗体进行亲和力标记,将标记的抗体通过亲和力色谱而纯化,然后标记物被裂解形成活泼的二硫化物。大量的催化基团能够通过二硫化物的交换反应而引入。通过此方法,在IgAMOP315抗体的结合部位引入了巯基(-SH),其催化香豆酯水解的速度比照样相提高了6×104倍。

四、抗体酶的应用前景

在抗体酶被发现的13年以后，他们才开始进入商业领域。目前已有一些公司，比如：美国的Med-Immune和Prolifaron公司以及以色列的AdvancedBiotechLtd.致力于抗体酶的商业应用，并且取得了一些业绩。

（一）、人工设计一些抗体酶来实现对某些手性药物的立体专一性合成和非酶催化系统的反应的催化。包括催化酯水解、糖苷键水解、Diels-Alder反应和Oxy-Cope重排反应等。在催化萘普生乙酯水解的抗体酶研究中，发现所获得的多克隆和单克隆抗体都能立体专一性地水解R构型的萘普生乙酯，从而开辟了一条抗体酶用于手性合成的道路，此技术已获授权发明专利。

（二）、有很多世界知名的实验室提出了许多不同的方案，期望将抗体酶技术应用于医药制造方面。其中之一就是利用抗体酶的水解产物来激活一些药物前体,通过瞄准肿瘤细胞活性，药物前体就能直接作用于肿瘤细胞，并且转化成细胞毒素的化合物。

（三）、一个在医学方面的应用是利用抗体酶来特异性的水解可卡因。目前美国的哥伦比亚大学正致力于这方面的研究，希望可以找到解决过量吸食毒品的方案。用可卡因磷酸单酯过渡态类似物为抗原制备的抗体酶能催化可卡因中苯甲酰基团的水解，其水解产物芽子碱甲酯和苯甲酸不具有可卡因的刺激作用，这为治疗可卡因依赖性的患者提供了可能。

以色列的AdvancedBiotechLtd.正在试图利用抗体酶技术生产一种药物来对付革兰氏阴性脓血症。

所有这些对抗体酶的研究都是为了得到一种具有特定序列的蛋白酶，从而为抗癌疗法以及新型疫苗的获得开辟一条新的道路。1、在诊断肝炎方面的应用

利用抗体酶技术可以方便的诊断出丙型,丁型,戊型肝炎.比如对于戊型肝炎,目前已经研制出一种IgM抗体酶免检测试剂盒。此试剂盒采用间接ELISA法，检测戊型肝炎病毒IgG抗体，包被抗原为合成肽(ORF2和ORF3)，酶标抗体为辣根酶标记的抗－μ单抗，试剂全部工作液化，可直接使用，包被板采用可掰板，可单人份检测，反应过程为50分钟.

2、在诊断胃肠道恶性肿瘤的应用

根据中华检验医学杂志(CHINESEJOURNALOFLABORATORYMEDICINE)的介绍，对于结直肠癌的辅助诊断和监测，常用的血清肿瘤生物学标志为癌胚抗原（CEA）、癌相关糖抗原（CA）19-9、CA72-4及CA242等。根据抗肿瘤单克隆抗体证实，血清肿瘤标志均为非特异的肿瘤相关抗原［1］，其检测肿瘤的敏感性及特异性均有限。尝试将以上与结直肠癌有关的血清肿瘤标志进行手术前后测定及单项、双项、3项、4项联合测定并进行比较，目的在于对各肿瘤标志在结直肠癌中的应用价值进行评价，并选择较佳的血清肿瘤标志组合，以提高检测结直肠癌的敏感性。

用基因工程人源化的抗体酶代替从细菌中得到对人体有毒副作用的天然酶，把该抗体酶与癌细胞表面抗原特异抗体结合，利用特异抗体，把抗体酶带到癌细胞的周围，分解药物前体，专一杀死癌细胞，大大减少了化疗的毒副作用。

3、在诊断艾滋病方面的应用

艾滋病（AIDS）是感染艾滋病病毒（HIV）后免疫功能逐渐丧失的结果。研究证明，除血液标本外，HIV感染者的尿液、唾液、泪液、精液中均可检测到抗HIV抗体。艾滋病的诊断一直以来以血清学检查阳性为基础。最近，一种新的艾滋病诊断试剂———尿液HIV－1抗体酶联免疫诊断试剂已经进入市场。

尿液HIV－1抗体酶联免疫诊断试剂与血清学诊断试剂比较，有其独特的优势：它不仅和血液HIV抗体酶联免疫诊断检测方法一样，具有较好的可信度，而且尿液中一般不存在HIV病毒，无针头采集尿液标本，不会引起皮肤损伤，消除了收集血液标本过程中引起的病毒传播的可能；其次尿液收集简便易行，便于大规模筛查。由于采样过程不需要针刺，建立在无损伤收集标本的基础上，消除了与职业暴露相关的危险因素，可以保护医护人员和被检测者避免查体时因针刺意外感染肝炎或艾滋病病毒的危险。因此，该检测试剂可用于除血源筛查以外人群的艾滋病HIV－1抗体筛查。4、在诊断妊娠反应方面的应用

单克隆抗体酶标绒毛膜促性腺激素检测法这是目前最先进的妊娠试验，灵敏度极高,阳性率几乎百分之百。用本法可在受精后10天左右即在停经之前就能确定诊断，而且操作简单，人人都能学会，也可以在家庭使用。

小结

取得了很大进展

抗体酶研究已取得很大进展，建立了制备抗体酶的技术（包括免疫法.化学法.基因工程和蛋白质工程等方法），通过这些技术不仅从单克隆抗体中获得了酶催化活性，而且从多克隆抗体中也获得了酶催化活性。个别抗体酶的催化反应已接近于天然酶的水平，天然酶催化的六大化学反应，抗体酶都可以进行催化。抗体酶还可以催化天然酶不能催化的反应，在工业及医学中应用的潜力已初见端倪。

存在的问题

尽管抗体酶的研究已取得很大进展，但还存在一些需要进一步发展的问题，如催化机制的研究。尽管像瑞士的诺华和美国的Bristol-MyerSquibb这样的跨国公司已经对于抗体酶的研究运用产生了很大的兴趣，并且已经与Dr.Lerner领导的研究小组进行了合作，共同开发抗癌药物。但目前对于抗体酶在工业方面的大部分应用还是处于实验阶段。

综上所述，催化抗体的出现不仅为人们开创了一条人工设计酶的新方法，也是人们对催化过程中催化剂的作用机理和催化剂与底物的相互识别有了进一步的认识。它无疑会对化学、生物学、医学等领域产生深远的影响。当然，抗体酶研究和运用还是刚刚起步，很多实践和理论上的东西有待解决。

在理论上：对抗体酶的催化效率的预测还刚起步；

在实践上：还没有找到一个普遍可行的筛选法；

在应用上：没有找到真正运用的抗体酶；

最重要的一点是：抗体酶与天然酶相比，抗体酶的催化效率和转换数远远低于天然酶，还不能成为真正意义上的酶。但随着抗体酶研究的深入，特别是抗体酶制备技术的成熟以及抗体酶结晶学研究的不断深入，科学家有希望达到有目的地改造和构建抗体酶，使之成为真正意义上的酶！

酶分子修饰与模拟

酶作为生物催化剂，其高效性和专一性是其他催化剂所无法比拟的。因此，日益增多的酶制剂已用于食品发酵、疾病诊治和预防、环境保护和监测、化工产品的生产，以及基因工程等生物技术领域。但是酶在实际应用中有局限性：1、作为异体蛋白在体内难于吸收、易引起免疫反应和被识别降解；2、酶蛋白经不起温度、酸碱、有机溶剂及时间的考验，

半衰期短、易变性失活；3、酶的活性、作用专一性和最适条件不一定能适应生产工艺要求，限制了酶制剂的应用范围。

对策——

酶分子工程

（MOLECULARENGINEERINGOFTHEENZYME）

分子酶工程可以从分子水平改造酶，弥补天然酶的缺陷，并赋予它们某些新的机能和优良特性。随着各学科及相关技术的发展，特别是对酶结构与功能的深入了解、基因工程及固定化技术的普及，使酶分子工程已进入实用阶段。总体来说酶的分子工程分两部分：一是分子生物学水平，即用基因工程方法对DNA或RNA进行分子改造，以获得化学结构更理想的酶蛋白；二是对天然酶分子进行改造（包括酶一级结构中氨基酸置换、肽链切割、氨基酸侧链修饰等)。

酶分子工程主要有以下几方面的内容1）化学修饰（一级结构改造）：对酶分子的侧链基团、酶活性中心中的必需基团进行化学修饰，改造酶性能、研究酶结构与功能的关系；2）变性、诱导与构象重建（高级结构调整）3）蛋白质工程（基因水平定位突变）：用分子生物学方法克隆酶或修饰基因以便产生新的酶（如突变酶），或设计新基因合成自然界不存在的新酶（如抗体酶）4）固定化酶：通过对酶分之内或分之间的交联，或与水不容性载体的结合制成，催化特定的反应。5）模拟酶：用化学方法合成新的有机催化剂，使其具有酶活性。

一、酶的化学修饰（一级结构水平的改造）

（原理、方法、应用）

化学修饰是分子酶工程的重要手段之一。只要选择合适的修饰剂和修饰条件，在保持酶活性的基础上，能够在较大范围内改变酶的性质，创造天然酶所不具备的优良特性，甚至创造出新的活性。

化学修饰方法虽多，但基本都是利用修饰剂所具有的各种化学基团特性，或直接或经过一定的活化过程，与酶分子上某氨基酸残基（一般尽量选酶活性非必需基团）产生化学反应，对酶分子结构进行改造。1、化学修饰原理

凡通过化学基团的引入或除去而使酶蛋白共价结构发生改变（侧链基团的取代、肽链的限制性水解、分子内或分子间的交联），都可称为蛋白质的化学修饰。达到：改造酶的作用特性（包括改变酶活性、专一性、对效应物响应性能及对辅助因子的要求）提高酶的稳定性扩大在体内应用可能性（防止在体内非专一性水解、减少和消除免疫原性以利于医疗应用）

用纤维蛋白的专一性单克隆抗体修饰尿激酶，使其溶血栓性提高了100倍

用乙醛酸修饰胰凝乳蛋白酶的表面氨基，形成亲水性的α－NHCH2COOH后，该酶对60°C热处理的稳定性增高了1000倍。

超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)、L－谷氨酰胺酶、L－门冬酰胺酶、尿酸酶等用PEG修饰后，完全消除了酶的抗原性和免疫原性，减慢了它们在动物血液循环中被清除的速度，酶的活力可以保存15％－45％。2、化学修饰方法的几个问题

决定化学修饰成败的关键是修饰的专一性，尽量少破坏必需基团，得到高的酶活力回收。为此，有时需要通过反复试验来确定。其中：对酶性质的了解：活性部位、稳定条件、反应最佳条件及侧链基团性质等；选择修饰剂考虑：1）分子量、修饰剂链长和对蛋白吸附性；2）修饰剂上反应基团的数目及位置；3）修饰剂上反应基团的活化方法和条件（一般要求较大分子量、良好的生物相容性和水溶性、分子表面有较多反应活性基团）；选择酶反应条件要注意：1）反应体系的溶剂性质、盐浓度、PH、温度、时间；2）酶与修饰剂的比例。参考：酶工程P.86(1)、试剂的选择—要根据修饰目的选择

例如对氨基修饰可有几种情况——修饰所有氨基而不修饰其它基团；仅修饰

-氨基；修饰暴露的或反应性高的氨基；修饰具有催化活性的氨基；例：如果修饰目的是希望改变蛋白质的带电状态或溶解性，则必须选择能引入最大电荷量的试剂。。。。（酶工程P86）用于修饰酶活性部位氨基酸残基的试剂应具备：选择性地与一个氨基酸残基反应；反应在酶蛋白不变性条件下进行；所标记的残基在肽链中稳定以易于分离鉴定；修饰反应的程度能简单测定；最常用的修饰剂——PEG类修饰剂

聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)通常没有免疫原性和毒性,不会破坏生物分子的活性，其生物相容性已通过美国食品和药物管理局(FDA)认证。特别是当酶经过PEG类修饰剂修饰后，修饰剂的许多优良性质也会在修饰蛋白中得到体现。PEG分子末端有两个能被活化的-OH基团，化学修饰时则多采用甲氧基聚乙二醇(MPEG)的衍生物为修饰剂。PEG分子量范围很宽，适合用作修饰剂或修饰剂出发原料的PEG的相对分子质量一般为500～20000。

PEG既溶于水，又溶于绝大多数有机溶剂，但不溶于乙醚、脂肪烃。(2)、反应条件的选择不造成蛋白质的不可逆变性（通过对照实验）；有利于专一性修饰（小心控制条件，尽可能在酶蛋白特定构象不变或少变的情况下进行）；温度、PH、反应介质和缓冲液；修饰剂专一性；

在所有影响化学修饰的反应条件中,PH值是最重要的一个条件,因为它决定了具有潜在反应能力的功能基团所处的可反应和不可反应的解离状态。一般情况下,增加PH可以提高反应速率,降低PH可以减小反应速率。反应活性较高的修饰剂可以在生理PH下与蛋白质耦合;而反应活性较低的修饰剂通常需要较高的PH。修饰反应的专一性则对应有一个优化PH值。(3)、反应的专一性

除考虑修饰试剂专一性、控制反应条件外，还可利用其它途径来实现修饰专一性：

利用酶蛋白质分子中某些基团的特殊性（如蛋白酶的丝氨酸与DFP）；选择不同的PH以控制相关功能基团的解离状态，从而有利于专一修饰（如卤代乙酸对半胱氨酸、甲硫氨酸、组氨酸等的作用）；

亲和标记试剂（如甲基苯磺酰氟作用于胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸上）；

差示标记（在底物或抑制剂存在下进行化学修饰）；

利用蛋白质状态的差异（如在结晶状态下反应）；

利用某些产物的不稳定性；

使用非特异试剂对特殊基团的标记；

非特异性试剂：不能区分活性部位内和活性部位外基团的试剂。

特殊基团:某些酶的活性部位含有活性部位以外没有的氨基酸残基，如（-HS基）。例如：木瓜蛋白酶中有7个半胱氨酸残基，其中的6个形成三对二硫桥，只有一个残基以自由巯基形式存在于活性部位，这时就可以用任何一种巯基试剂来标记（如碘乙酸）得到巯基修饰与活力丧失相平行的结果。若是非特殊基团，要充分利用活性部位中某一基团具有特别高的反应性的有利条件进行化学修饰。（如胰凝乳蛋白酶的Ser-195与DFP的作用）+x-y

亲和标记主要利用酶和底物特异结合的性质设计标记试剂。

差示标记是非特异性试剂标记的一个发展，要求被标记的活性部位基团有特殊灵敏的反应性。+RRR(a)+PP+RRP-PR+R*RR*(b)（4）、酶蛋白侧链基团的常用修饰水溶性的碳二亚胺类特定修饰酶的羧基；赖氨酸氨基的烷基化（卤代乙酸等）；具有两个临位羰基的化合物修饰精氨酸胍基（丁二酮等）；烷基化试剂修饰巯基；碘代乙酸修饰组氨酸咪唑基；还有色氨酸吲哆基、甲硫氨酸甲硫基、酚基、脂肪族羟基等；二硫键的化学修饰氨基的化学修饰羧基的化学修饰

应用比较多的修饰方法1.酶的表面化学修饰

(1).大分子修饰：可溶性大分子，其中相对分子量在500-20000u范围内的PEG（聚乙二醇）类修饰剂应用最广，既能溶于水，又可以溶于大多数的有机溶剂，它一般没有免疫原性和毒性。化学修饰时多采用单甲氧基聚乙二醇（MPEG)(2).小分子修饰：利用小分子化合物对酶的活性部位或活性部位之外的侧链基团进行化学修饰，以改变酶学性质。已经被广泛应用的小分子化合物主要有氨基葡萄糖，乙酸酐，硬脂酸，邻苯二酸酐等。(3).交联修饰：使用双功能基团试剂如戊二醛，PEG等将酶蛋白分子之间，亚基之间或分子内不同肽链部分间进行共价交联，可使酶分子活性结构加固，并可提高其稳定性，增加了酶在非水溶液中的使用价值。(4).固定化修饰：通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价连接到惰性载体上后，由于酶所处的微环境的改变，会使酶的性质（最适ph，最适温度，稳定性等）改变。2.酶分子内部修饰(1).非催化活性基团的修饰(2).蛋白主链的修饰(3).催化活性基团的修饰(4).与辅因子相关的修饰

3.结合定点突变的化学修饰

通过一些可控制的方法在酶的关键活性位点引入一个氨基酸残基，然后利用化学修饰法将突变的氨基酸残基进行修饰，引入一个小分子化合物，得到一种称为化学修饰突变酶（CMM)的新型酶。3、酶化学修饰的应用

酶经过化学修饰后会产生的变化：1.提高生物活性；2.增强在不良环境中的稳定性；3.针对特异性反应降低生物识别能力，解除免疫原性；4.产生新的催化能力；

在医药方面：化学修饰可以提高医用酶的稳定性，延长它在体内半衰期，抑制免疫球蛋白的产生，降低免疫原性和抗原性。

在生物技术领域：化学修饰酶能够提高酶对热，酸，碱和有机溶剂的耐性，改变酶的底物专一性和最适ph等酶学性质。

在酶结构功能研究中：1.研究酶空间结构与功能的关系，如酶的活性中心研究；2.确定氨基酸残基的功能；3.测定酶分子中某种氨基酸的数量。4、酶蛋白化学修饰的局限性1.某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性是相对的，很少有对某一氨基酸侧链绝对专一的化学修饰剂。2.化学修饰后酶的构象或多或少都有一些改变，因此这种构象的变化将妨碍对修饰结果的解释。3.酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行，目前还不能用化学修饰的方法研究非极性氨基酸残基在酶结构与功能关系中的作用。4.酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关系能提供一些信息，如某一氨基酸残基被修饰后，酶活力完全丧失，说明该残基是酶活性所“必需”的，为什么是必需的，还得用X射线和其他方法来确定。因此化学修饰法研究酶结构与功能关系尚缺乏准确性和系统性。（二）、变性、诱导与构象重建

（对酶高级结构调整）

酶肽链变性松散后，使其在有底物类似物或抑制剂存在的非天然条件下复性，酶将折叠成所需要的特殊结构，产生新的性状，此即变性诱导构象重建的原理

实验证据：在8mol/L尿素存在下，用巯基乙醇处理天然RNase,其二硫键全部断裂，肽链松散，活性全部丧失，但当用透析法除去尿素、巯基乙醇后，RNase活力全部恢复，而且复原后产物其物化性质与天然RNase完全相同；然而在随机情况下，8个HS—形成4个—S—S时，应有105种不同方式，但在复原过程中，走向随机的RNase肽链却只选择了其中一种方式（即与天然构象完全相同）.

（三）、蛋白质工程

（基因水平上进行蛋白质改造）以重组DNA技术为基础，结合X-衍射分析技术、蛋白质溶液构象理论及计算机辅助设计发展起来的一种定点定位修饰技术体系，也是在基因水平进行蛋白质改造的技术科学。常用：化学全合成法、限制酶酶切片断取代法等。蛋白质工程在酶的改造方面目前研究比较系统的例子是组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂（TpA）P81蛋白质工程的主要方法化学全合成法限制性内切核酸酶酶切片段取代法寡核苷酸引物指导的定点突变

二、酶的模拟

早在20世纪中叶，人们就已认识到研究和模拟生物体系是开辟新技术的途径之一，并自觉地把生物界作为各种技术思想、设计原理和发明创造的源泉，通过对生物体系结构与功能的研究，为设计和建造新的技术提供新思想、新原理、新方法和新途径。酶是自然界经过长期进化而产生的生物催化剂，对酶这样的高效催化剂的结构功能的设计和模拟，是当今自然科学领域中的前沿课题之一。模拟酶的基本概念

模拟酶又称人工酶或酶模型，它是有机化学的一个分支。由于天然酶的种类繁多，模拟的途径、方法、原理和目的不同，对模拟酶至今没有一个公认的定义。一般认为，所谓模拟酶就是利用有机化学的方法合成一些比酶简单的非蛋白质分子，它们可以模拟酶对底物的络合和催化过程，既可达到酶催化的高效性，又可以克服酶的不稳定性。对酶的模拟已不仅局限于化学手段，化学和分子生物学方法的结合使酶模拟更加成熟起来。模拟酶的分类单纯酶模型：以化学方法通过天然酶活性的模拟来重建酶活性；机理酶模型：通过对酶作用机制如识别、结合和过渡态稳定化的认识，来指导模型酶的设计和合成；单纯合成的酶样化合物：化学合成具有酶样催化剂活性的简单分子；目前，较为理想的小分子仿酶体系有环糊精、冠酶、环番、环芳烃和卟啉等大环化合物；大反子仿酶体系有聚合物酶模型，分子印迹酶模型和胶囊酶模型等。固定化酶

（ImmobilizedEnzyme）

酶在水溶液中不稳定，一般不能反复使用，而且不易与产物分离，不利于产物的提纯和精制。针对这些限制酶广泛应用的因素，将水溶性酶或游离细胞经过化学或物理手段处理，将酶束缚在一定的空间内，限制酶分子在此区间进行活跃的催化作用，成为不溶于水的固定化的酶或细胞。

固定化酶的制备方法、性质、固定化酶反应器和应用

1953年，Grubhofev和Schleith首先开始了酶固定化研究，并第一次实现了酶的固定化。

1960年，日本的千畑一郎开始了氨基酰化酶固定化研究，开始了将固定酶应用在工业上的第一步。

1969年，千畑一郎成功地将氨基酰化酶反应用于DL-AA的光学分析，实现了酶连续反应的工业化。这是世界上固定化酶用于工业的开端。

1973年，千畑一郎再次在工业上成功地固定化大肠杆菌细胞，成功实现了L-天冬氨酸连续生产。

吸附法包埋法共价结合法共价交联法一、固定化酶(细胞)的制备方法(一)、吸附法吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的

次级键相互作用而达到固定目的的方法。只需将酶液与具有活泼表面的吸附剂接触，再经洗涤除去未吸附的酶便能制得固定化酶。是最简单的固定化技术，在经济上也最具有吸引力.

根据吸附剂的特点又分为两种：物理吸附法(physicaladsorption)是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。常用的载体有：高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、微空玻璃等无机吸附剂，纤维素、胶原以及火棉胶等有机吸附剂。离子结合法(ionbinding)是指在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基间的相互作用而达到酶固定化的方法（离子键）。最常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等；其他离子交换剂还有各种合成的树脂如AmberliteXE-97、DoweX-50等。离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。

影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素:1.PH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。2.离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。3.蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。4.温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。5.吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子慢得多。6.载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越强。多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小。

吸附法的优点：操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过程可同时达到纯化和固化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。

吸附法的缺点：酶和载体的结合力不强，会导致催化活力的丧失和沾污反应产物；经验性强。

世界第一例获得工业应用的固定化酶是

DEAE-SephadexA-25吸附的氨基酰化酶反应用于

DL-AA的光学分析。（二）、包埋法

包埋法是将酶物理包埋在高聚物网格内的固定化方法。(如将聚合物的单体和酶溶液混合后，再借助聚合促进剂的作用进行聚合，将酶包埋于聚合物中以达到固定化的目的）。

1、凝胶包埋法：

将酶分子包埋在高聚物网格内的包埋方法。

聚丙烯酰胺包埋是最常用的包埋法：

先把丙烯酰胺单体、交联剂和悬浮在缓冲溶液中的酶混合，然后加入聚合催化系统使之开始聚合，结果就在酶分子周围形成交联的高聚物网络。它的机械强度高，并可以改进酶脱落的情况，在包埋的同时使酶共价偶联到高聚物上，可以减少酶的脱落。

海藻酸钠也可以用来作为包埋载体，它从海藻中提取出来，可被多价离子Ca2+、Al3+凝胶化，操作简单经济。

K-角叉莱胶（卡拉胶）冷却成胶或与二、三价金属离子成胶。包埋条件温和无毒性，机械强度好。固定化的酶活回收率和稳定性都比聚丙烯酰胺法好。

胶原和明胶也是常用的包埋载体。2、微囊化包埋法微囊法主要将酶封装在胶囊、脂质体和中空纤维中。胶囊和脂质体主要用于医学治疗，中空纤维主要适于工业使用。界面沉淀法是一种简单的物理微囊化法，它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。界面聚合法是用化学手段制备微囊的方法。他所得的微囊外观好，但不稳定，有些酶还会因在包埋过程中发生化学反应而失活。

包埋法的优点在于它是一种反应条件温和、很少改变酶结构但是又较牢固的固定化方法。

包埋法的缺点是只有小分子底物和产物可以通过高聚物网架扩散，对那些底物和产物是大分子的酶并不适合。这是由于高聚物网架会对大分子物质产生扩散阻力导致固定化酶动力学行为改变，使活力降低。

（三）、共价偶联法

是目前研究中最为活跃的方法。它的原理是酶蛋白分子上的功能基团和固相支持物表面上的反应基团之间形成共价键，因而将酶固定在支持物上（借助共价键将酶的非活性必需侧链基团和载体的功能基团进行偶连）。

共价偶联法中的几个影响因素

1、载体的物化性质要求载体亲水，并且有一定的机械强度和稳定性，同时具备在温和条件下与酶结合的功能基团。

2.偶联反应的反应条件必须在温和PH、中等离子强度和低温的缓冲溶液中。

3.所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的其它功能基团副反应尽可能少。

4.要考虑到酶固定化后的构型，尽量减少载体的空间位阻对酶活力的影响。

共价偶联法的优点：得到的固定化酶结合牢固、稳定性好、利于连续使用，是目前应用和报道得最多的一类方法。

共价偶联法的缺点也很明显。载体活化的操作复杂，反应条件激烈，需要严格控制条件才可以获得较高活力的固定化酶。同时共价结合会影响到酶的空间构象，从而对酶的催化活性产生影响。

（四）、交联法

共价交联法的基本原理是酶分子和多功能试剂之间形成共价键得到三向的交联网状结构交联法是利用双功能或多功能试剂在酶分子间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进行胶联反应，把酶蛋白分子彼此交叉连接起来，形成网络结构的固定化酶。能起交联作用的试剂很多，但目前常用的交联试剂是戊二醛和双耦联苯胺-2,2’-二磺酸。交联法常与吸附法结合使用，或者与包埋法配合，目的是使酶紧紧地结合于载体上。

共价交联法的四种形式：酶直接交联法：

在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。固定化依赖于酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。操作简单，但是缺乏选择性，活力回收往往不高。酶辅助蛋白交联：

当可得到的酶量有限，可以使用第二个“载体”蛋白来增加蛋白质浓度，从而使酶与惰性蛋白共交联的方法。这种“载体”蛋白即辅助蛋白，可以是白蛋白、明胶、血红蛋白等。吸附交联法：

此法先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联，用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。载体交联法：

用多功能试剂的一部分功能基团化学修饰高聚物载体，而其中的另一部分功能基团偶联酶蛋白。

四种固定化酶制备方法的特点小结物理吸附包埋法共价交联法共价结合法制备易易难难结合力弱强强强酶活力高高中中底物专一性无变化无变化有变化有变化再生可能不可能不可能不可能固定化费用低中中高制法特性1.必须注意维持酶的催化活性和专一性2.酶与载体结合牢固3.载体的机械强度4.固定化酶要有最小的空间位阻5.载体稳定，不可与底物、产物发生反应6.固定化酶要廉价固定化方法与载体的选择

固定化细胞

固定化细胞是指直接将细胞固定在水不溶性载体上，在一定的空间范围内进行生命活动（生长、繁殖和新陈代谢）的细胞。

固定化细胞的优点：

1、可增殖，细胞密度大，可获得高度密集而体积小的生产菌集合体。

2、发酵稳定性好，可以较长时间反复使用或连续使用。

3、发酵液中含菌体较少，有利于产品分离纯化。

4、有利于需要辅酶和多酶系统才能进行的反应。

固定化酶(细胞）应用实例固定化酶和固定化细胞应用生产时间氨基酰基转移酶DL-氨基酸的旋光度解析1969葡萄糖异构酶将葡萄糖异构变为果糖1973青霉素酰胺酶生产6-APA1973天冬氨酸酶生产L-天冬氨酸1973延胡索酸酶生产L-苹果酸1974ß-半乳糖苷酶水解乳糖1977L-天冬氨酸ß-脱羧酶生产L-丙氨酸1982

二、固定化酶（细胞）的性质

有一定的机械强度且稳定性好，催化剂与系统分相。固定化酶在使用前可充分洗涤，不带进杂质，在反应中酶与产物自然分开，所以产物易提纯，收率也高。酶与细胞经过固定化以后，稳定性大为提高，可较长期使用与储藏，并可以再生。

能反复使用，可大大降低生产成本；同时也为实现生产的管道化、连续化与自动化提供了可能。（一）、影响固定化酶（细胞）性质的因素

酶经过固定化后引起的性质改变，不外乎两种原因：一是酶本身的变化，二是受固定化载体的物理或化学性质的影响。就载体物化性质和固定化过程影响而言，主要存在以下三种影响效应：

分配效应

空间障碍效应

扩散限制效应

1、分配效应由于载体和底物的性质差异引起了微环境和宏观环境之间的性质不同。微环境是在固定化酶附近的局部环境，而将主体溶液称为宏观环境。由这种不同造成的底物、产物和各种效应物在两个环境之间的不同分配，被称为分配效应。

2、空间障碍效应固定化之后，由于酶的空间自由度受到限制(因为载体的空隙太小，或者固定化方式与位置不当，给酶的活性部位造成了空间屏障)，使酶分子的活性基团不易于底物或效应物接触，影响酶分子的分子活性中心对底物的定位作用,所造成的对固定化酶的活力的影响效应，被称为空间障碍效应。

3、扩散限制效应酶固定化使生物催化反应从均相转化为多相，于是产生了扩散阻力：

1）、外扩散阻力是底物从宏观环境向酶颗粒表面传递过程中的一种扩散限制效应，它发生在反应之前，发生在固定化颗粒周围的液膜层。它会使底物在固相酶周围形成浓度梯度，通过增加搅拌速度和底物流速的方法可以减少外扩散效应。

2）、内扩散阻力是指底物分子达到固相酶表面后传递到酶活性部位时的一种扩散阻力，它与催化反应同时进行。载体小而弯曲的细孔是产生内扩散阻力的要原因。因此使用低分子量底物，小的粒径、载体孔尽可能大而直且互相连通，或仅仅将酶固定在载体表面都可以降低这种内扩散阻力。

（二）、固定化酶（细胞）性质的改变1、固定化酶的活力在大多数情况下比天然酶下降，其专一性也会受到影响发生改变。

活力下降的原因：

酶分子在固定化过程中，酶的空间构像发生了变化，甚至活性中心的氨基酸也会参加反应。

固定化后的空间障碍效应的影响。

内扩散阻力的影响使底物分子与活性中心的接近受阻。

包埋法时被高分子物质半透膜包围。

2、固定化后酶稳定性提高

稳定性提高的原因：

固定化后的酶与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形。

酶活力的缓慢释放。反应开始只有部分酶起作用，其余部分仅在开始起作用的酶变性后才起作用。

抑制自降解，提高了酶稳定性。

3、固定化酶（细胞）的作用pH变化

酶固定化后，对底物的最适PH曲线常常发生偏移。一般来说，带负电荷载体制备的固定化酶，其最适PH值较游离酶偏高，反之，若使用带正电荷载体的话，其最适PH值较游离酶偏低，即向酸性偏移。

为什么？（从分配效应说明）

4、固定化酶（细胞）的最适温度的变化

酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综合结果。因为固定化后，酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高，这是很有利的结果。

5、米氏常数Km的变化

固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。简单说，由于高级结构变化及载体影响引起酶与底物亲和力变化，从而使Km变化。而这种Km变化又受到溶液中离子强度影响：离子强度升高，载体周围的静电梯度逐渐减小，Km变化也逐渐缩小以至消失。

（三）、固定化酶（细胞）的活力

固定化酶的活力即是固定化酶催化某一特定化学反应的能力。其大小可以用在一定条件下它所催化的某一反应的反应初速度来表示。

它的单位可定义为每毫克干重固定化酶每分钟转化底物的量：用μmol/min·mg或μmol·min-1/cm2

1）、活力测定方法分为：

间歇测定：在搅拌或振荡反应器中，在与溶液酶同样测定条件下进行，然后间隔一定时间取样，过滤后按常规进行测定。连续测定：固定化酶装入具有恒温水夹套的柱中，以不同流速流过底物，测定酶柱流出液，根据流速和反应速度之间关系，算出酶活力。

活力回收=×100%3）、固定化酶（细胞）的半衰期在连续测定条件下，固定化酶的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间称为固定化酶的半衰期。以t1/2表示。固定化酶的操作稳定性是影响使用的关键因素，半衰期是衡量稳定性的指标。

2）、固定化酶的活力回收

固定化酶（细胞）热稳定性变化固定化酶（细胞）对有机试剂（乙醇）稳定性变化下一幅固定化酶（细胞）对酶抑制剂（尿素）的稳定性变化下一幅固定化酶（细胞）对PH稳定性变化

三、固定化酶反应器

批量式搅拌桶式反应器

BatchStirredtankreactor,BSTR

结构简单，不需要特殊设备，适于小规模实验。当前食品和饮料工业有采用这种形式反应器。一般应用溶液酶或粗酶制剂催化，酶不回收，待反应转化至一定程度后，通过加热或其他方法直接使之失效除去。但在反复过滤或离心回收过程中，易造成酶的失效损失。工业上很少用.

连续流搅拌桶式反应器ContinuousStirredtankreactor,CSTR

催化剂采用颗粒状的固定化酶，少数应用片状固定化酶。运转过程中要不断分出部分反应液，同时补充等量的新鲜底物溶液，为不致使酶随反应液流失，所以在它的出口处通常有滤膜。利于有底物抑制场合.

连续搅拌桶式超滤反应器CSTR/Ultrfitrationreactor,CSTR/UFR

由连续流搅拌桶式反应器和超滤装置组合而成，为小分子量产物与高分子底物的分离、底物较彻底的转化以及溶液酶或固定化酶的反复使用提供了可能。但酶易因循环超滤而失效损失。

填充式反应器PlugFlowreactor,PFR

床内用颗粒状或片状固定化酶填充，运转时，底物按一定方向以恒定速度通过反应床。使用最普遍.

流动床反应器

Fluidizedbedreactor,FBR

底物溶液以足够大的流速向上通过固定化酶床层，使固体颗粒处于流化状态。混合程度高，故传热、传质情况良好。可用于处理粘性强和含有固体颗粒的底物，或用于需要供应气体或排放气体的反应。

循环流式反应器

Recyclereactor,RCR

把部分流出物与加料流混合，然后再令其进入反应器。特点是可以提高液体的流速和减少底物向固定化酶表面传递的阻力。

固定化酶反应器的选择依据固定化酶的形状底物的物理性质酶反应动力学特性酶的稳定性操作要求及反应器费用

1、固定化酶的形状一般言之，颗粒状或片状固定化酶对连续流搅拌桶式反应器和填充式反应器类型的反应器均可适用。但膜状和纤维状的固定化酶则不适于连续流搅拌桶式反应器，而适用于填充式反应器。另一方面，如果固定化酶易变形、易粘结或颗粒细小时，那么在填充于填充式反应器后，往往会引起高的压力降和堵塞床层，并且在大规模生产中无法实现高的流率。此时宜采用流动床反应器。

2、底物的物理性质底物分三种情况：溶解性物质、颗粒物质与胶状物质。溶解性底物显然对任何类型反应器均不会造成困难。颗粒状和胶状底物则往往会导致床层堵塞，对此可用循环反应器或流动床反应器。连续流搅拌桶式反应器只要搅拌速度足够高，能维持底物和固定化酶良好的悬浮状态，也可用于颗粒状底物。但高的搅拌速度会导致固定化酶从载体上被剪切下来，所以转速不能太高。3、酶反应动力学特性

一般而言，填充床反应器在固定化酶反应器中占有主导地位，它适合于产物抑制的场合；但在底物抑制的系统中，则连续流搅拌桶式反应器的性能又优于填充床。流动床反应器因其流动特性接近连续流搅拌桶式反应器，故也适宜于底物抑制的反应。

4、酶的稳定性在反应器操作过程中，由于搅拌浆或液流的剪切作用，常会使固定的酶从载体上脱落下来，或由于磨损，引起粒度的减小而影响固定化酶的操作稳定性，其中尤以连续流搅拌桶式反应器最为严重。为解决这一问题而改进反应器设计，是把酶直接粘接在搅拌轴上，或把固定酶设置在与轴相连的金属网篮内。5、操作要求及反应器费用

连续流搅拌桶式反应器是最便宜的，它结构简单，且具有良好的操作性，适应性强；而其他类型的反应器，则都需为特定的生产过程专门设计和制造。在讨论反应器价格的同时，还应该考虑固定化酶本身的费用，及在各种反应器中的稳定性。四、固定化酶的应用固定化酶在工农业生产上的应用固定化酶在医药治疗上的应用固定化酶在分析化学中的应用固定化酶与基础理论

固定化酶在工农业生产上的应用

产物

酶或细胞

固定化方法

原料L-氨基酸果糖浆6APAL-门冬氨酸L-苹果酸低乳糖牛奶乳糖干蛋白果汁脱苦啤酒植物白脱脂肪酸氨基酰化酶葡萄糖异构酶或含该酶之菌体青霉素酰胺酶含有门冬氨酸的菌体含有反丁烯二酸酶的菌体乳糖酶碱性蛋白酶葡萄糖氧化酶和氧化氢酶柚苷酶木瓜蛋白酶脂肪酶脂肪酶载体结合法载体结合法或交联法载体结合法胶格包埋法胶格包埋法载体结合法载体结合法胶格包埋法载体结合法载体结合法或包埋法胶格包埋法载体结合法乙酰-DL-氨基酸葡萄糖青霉素G反丁烯二酸反丁烯二酸牛奶牛奶蛋白桔类果汁生啤酒植物油植物油

产物

酶或细胞

固定化方法

原料类固醇L-丙氨酸D-苯甘氨酸ATP核苷酸类味精乙醇啤酒L-亮氨酸乙酸乳酸淀粉酶杆菌肽氢气含脱氢酶及羟化酶的菌体含有L-门冬氨酸、β-脱羧酶的菌体氨基酰化酶乙酰激酶5’-磷酸二酯酶，5’-腺苷酸脱氨酶Sacharomycescarlsbergensie或S.Cerevisiae同上SerratiamarcescensAectobcter.sp.乳酸杆菌与酵母BacillussubstilisBacillsp.ClostridiumbutyicumRhodospirilliumrubrum胶格包埋法包埋法载体结合法载体结合法载体结合法角叉胶或聚丙烯酰胺胶包埋聚乙烯氯或多孔砖吸附或海藻酸包埋角叉胶包埋水合氧化钛吸附明胶包埋聚丙烯酰胺胶包埋聚丙烯酰胺胶包埋聚丙烯酰胺或琼脂包埋类固醇前体L-门冬氨酸乙酰-DL-苯基苷氨酸ADPRNA葡萄糖培养基苏氨酸培养基乙醇培养基

固定化生长菌体在三废处理上的应用应用内容

菌体

固定化方法

毒物废水处理脱氮作用CandidatropicalisPsendomonasPutida各种微生物混合培养PseadomonasspMicrococcusderitrificans聚丙烯酰胺胶包埋聚丙烯酰胺胶包埋皂土和Mg＋＋或聚氨基甲酸乙酯海绵活性炭吸附液膜酚苯废水亚硝酸、硝酸

固定化酶在医药治疗上的应用

溶液酶的应用缺陷：酶作为异体物质，在体内应用会导致免疫反应酶是蛋白质，在体内易被网状内皮系统移除和被蛋白质酶水解破坏由于稀释效应，药物酶无法集中于靶器官组织以达到治疗所需的最适高浓度

1、转入体内发挥作用（口服和注入）

口服：最初主要限于消化酶类，近年来也有人尝试将酶以口服方式用于尿中毒等疾患的治疗。口服的优点是药物通过粘膜吸收后能迅速进行扩散，进入体内，通常不会引起免疫反应。注入：是最有实用价值的一种方式，溶液酶的弱点集中于此方式。固定化酶可很好的地解决这一问题，办法是将药物酶包埋于半透膜中，可容许小分子底物自由出入包埋膜，而药物酶和破坏它的蛋白水解酶以及其他免疫因子等不会直接接触，因而可延长酶在体内的半寿期和避免免疫过敏反应。如果选择载体适宜，或者在载体上偶联适当成分，还可使药物酶比较集中的送到靶细胞。

2、通过“体外循环”做成人工脏器

固定化酶也可做成“人工脏器”参与体外循环，应用有两方面：用于除去有害的毒性物质及有潜在毒害作用的代谢产物除去氨基酸，使需要这些物质的病变组织“饿死”；治疗时只需将患者的血液引出体外，通过由固定化酶等构成的“人工脏器”加以处理，然后再回流体内。

酶应用方式

载体应用对象半寿期

优缺点尿酸酶门冬酰胺酶脲酶脂肪酶酪氨酸酶谷氨酰胺酶β-葡糖苷酸酶β-葡糖苷酸酶胆红素葡糖醛酸基转移酶过氧化氢酶组成体外循环移接体内循环口服体内循环体内循环体内循环体内循环体内循环体内循环血液透析装置Dacron脉管修复用和移接管尼龙微囊肠衣包被可溶性的聚顺丁烯二酸与聚丙烯酸聚合物可溶性的聚乙二醇血影细胞脂质体和聚乙烯吡咯烷酮结合的微粒体尼龙微囊急淋白血病尿胰机能不全癌瘤癌瘤取代和补偿先天缺失补偿先天缺失黄疸约2d1d1d24h24h18h短暂优点：加速尿酸移去缺点：需移去尿素优点：无免疫原性质优点：易缺点：消亡快；载体有毒优点：抗酸优点：最适pH向中性偏优点：无抗原性半寿期长优点：抗原性优点：载体能被代谢缺点：对载体内含物敏感优点：不需分离酶缺点：需辅助因子扩散优点：能做成糊状缺点：在唾液很快移除

包埋药用酶的载体可溶性载体聚乙烯吡咯酮烷多糖或糖肽聚乙二醇聚氨基酸以及血清白蛋白其他（核酸和脂类物质等）不可溶性载体半透性聚合酶脂质体红血球血影细胞

固定化酶在分析化学中的应用

固定化酶在生化分析和临床检验中的应用也是一个十分重要的领域，它的发展非常迅速，这不仅因为它们比较稳定，可反复使用，能实行自动化、连续化等，而且因为它们对抑制剂和活化剂比较不敏感，因此可用于较复杂体系的检测。分析化验中应用的固定化酶大体分为两类：酶传感器(酶电极)

固定化酶柱检测器,包括固定化酶柱和检测器

固定化酶与基础理论

1、用固定化酶研究亚基间关系：在适宜的条件下将寡聚体酶的一个亚基和载体偶联固定变性并除去其他亚基复性及活性检测亚基重组和酶性质的测定

2、应用固定化双酶或多酶系统进行模拟试验能获得一些有意义的结果将己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶固定化在一起，结果观察到偶联反应的初速度显著升高，而中间产物积累达到恒态水平所需的潜伏期大大缩短甚至消失。将上述两种酶和ATP再生系统同固定于白蛋白上，然后用能透过葡萄糖、但不能透过葡萄糖-6-磷酸的膜进行包埋，结果，在体外实现了“反抗”浓度梯度的葡萄糖的“活性运转”。3、通过固定化技术来改变酶的特性是酶分子修饰模拟的一个方面内容。

酶活性调节方式

酶活性调节的实例：

凝血酶、胰蛋白酶激活

糖元磷酸化酶活性转化

母体分娩后母乳中乳糖合成

丙二酸抑制琥珀酸脱氢酶活性

苏氨酸到异亮氨酸的代谢途径控制

多种调节方式：

浓度调节（合成降解调节)；

生理调节(激素调节)；

共价修饰调节（可逆，不可逆)；抑制剂调节；

反馈调节（别构调节）；

存在方式调节（多酶体系）；

寡聚酶的聚合、解聚调节；

1.调节酶在细胞内的浓度

如：大肠杆菌的葡萄糖效应，即在有葡萄糖存在时，它不利用乳糖。原理可以用乳糖操纵子模型来解释。

腺苷酸环化酶

AMPcAMP+H2O

磷酸二脂酶乳糖操纵子模型

2.

生理调节或激素调节在特殊生理条件下，分泌某一种激素来调节酶的活性。如：乳腺组织中的乳糖合成酶。

乳糖合成酶是蛋白A和蛋白B两组分构成的复合物，可以催化乳糖合成反应：

EUDP-半乳糖+葡萄糖乳糖+UDP

蛋白A不能催化上述反应而能催化下述合成反应：UDP-半乳糖+N-乙酰葡糖胺N-乙酰半乳糖胺+UDP

蛋白B本身无催化能力，但其与蛋白A结合，可以改变蛋白A的底物专一性。A

3、共价修饰调节

不可逆共价调节——酶原激活

◆一些酶（主要是消化酶和执行防御功能的酶）在细胞内以无活性前体形式（即酶原）合成和分泌，然后输送到胞内外作用部位去，当功能需要时就会被活化而起作用。可以想象，必须有一种调控机制，使其在胞内合成时处于失活状态，而在需要时激活；◆在酶原激活过程中，酶原分子结构发生了这样的变化：

首先，酶原分子被切去若干小段，即发生一级结构变化、

一级结构变化引起酶分子活性部位构象变化，形成能与特异性底物相结合的完整的疏水口袋。胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶Ser14—Arg15Thr147—Asn148A链B链C链胰凝乳蛋白酶原（无活性）π--胰凝乳蛋白酶（有活性）α--胰凝乳蛋白酶（有活性,稳定）α--胰凝乳蛋白酶（三链间有二硫键）◆α--胰凝乳蛋白酶为稳定的形式，A、B两链及B、C两链间各通过一对大的二硫键相连，其活性只有π--胰凝乳蛋白酶的2/5◆

酶活性中心的氨基酸残基来自B、C二链

胰凝乳蛋白酶原受胰蛋白酶作用后，Arg15-Ile16间的肽键被打断，形成了新的Ile16末端，这个新末端的氨基再与酶分子内部的Asp194发生静电作用,

触发一系列的构象变化：Met192从酶分子的深层移动到酶分子的表面，第187及第193残基更加舒展等，这些改变的总结果是造成一个口袋——允许带芳香族的底物或带一个较大的非极性脂肪族链的底物进入专一性部位

消化系统其它蛋白水解酶原的激活胃蛋白酶原（pepsinogen）由胃壁细胞分泌出来，在胃酸H+作用下，低于pH5时，酶原自动激活，失去44个氨基酸残基，转变为高度酸性的，有活性的胃蛋白酶胰蛋白酶原（trypsinogen）进入小肠后，在有Ca2+的环境中受到肠激酶的激活，赖氨酸-异亮氨酸之间的肽键被打断，水解失去一个6肽，使构象发生一定变化后，成为有活性的胰蛋白酶羧肽酶原A弹性蛋白酶原胰蛋白酶原胰蛋白酶六肽肠激酶羧肽酶原羧肽酶弹性蛋白酶原弹性蛋白酶胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶+胰蛋白酶对各个胰脏蛋白酶原的激活作用

综上所述，酶原激活有两个特点：是蛋白质肽链的水解过程，不可逆激活后，不能变为酶原状态，因而这是“一次性”的调节，能及时地从靶部位通过自身催化或组织蛋白酶的作用而降解移去都是通过级联系统实现的快速的信号放大过程，以完成特定功能

可逆的共价调节

由于其他的酶对其结构进行共价修饰，而使其在活性形式与非活性形式之间进行互变.第一种类型是磷酸化酶及其他的一些酶，它们通过接受ATP转来的磷酸基的共价修饰，或脱下磷酸基，来调节酶活性：酶的无活性形式酶的有活性形式最典型的例子是动物组织中的糖原磷酸化酶：（葡萄糖）n+Pi（葡萄糖）n-1+1-磷酸-葡萄糖E糖原磷酸化酶的活性形式及非活性形式间的平衡，是磷酸基共价地结合到酶上或从酶上脱下，从而控制调节磷酸化酶的活性糖原磷酸化酶及其他受共价修饰调节的调节