1.2微生物的培养技术及应用（一）（学生版）

《第1章发酵工程》第2节微生物的培养技术及应用一微生物的基本培养技术必会知识考点梳理拓展延伸易错警示必会知识一培养基的配制1．培养基的概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质—培养基，用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。2．培养基的分类：按照物理性质不同分为三类。培养基种类特点用途液体培养基不加凝固剂工业生产固体培养基加凝固剂，如琼脂微生物分离、鉴定等半固体培养基加少量凝固剂观察微生物运动、保存菌种3．营养组成：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐等营养物质，此外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。以1000mL牛肉膏蛋白胨培养基为例。1000mL牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成培养基组成提供的主要营养牛肉膏5g碳源、磷酸盐和维生素等蛋白胨10g氮源和维生素等NaCl5g无机盐H2O定容至1000mL水(1)牛肉膏又称牛肉浸膏，是采用新鲜牛肉经过剔除脂肪、消化、过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。有牛肉自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色。(2)蛋白胨是将肉、酪素或明胶用酸或蛋白酶水解后干燥形成的淡黄色粉剂，具有特殊的肉香。蛋白质经酸、碱或蛋白酶分解后也可形成蛋白胨。(3)牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用广泛的普通细菌基础培养基。由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖使用。在该培养基中，牛肉膏是主要的碳源，蛋白胨是主要的氮源。4．培养基中碳源和氮源的主要来源及作用来源主要作用碳源无机碳源：CO2、NaHCO3等：有机碳源：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等主要用于合成微生物体内的各种有机物，有机碳源是异养微生物的主要能源物质氮源无机氮源：N2、氨、铵盐、硝酸盐等：有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等主要用于合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物不是所有微生物的培养基中都需要加入碳源、氨源(1)自养微生物能利用无机碳源(比如空气中的CO2)，培养基中不用添加碳源；(2)固氮微生物可利用N2作为氮源，培养基中不用加入氮源。氨是硝化细菌的氨源，硝化细菌利用氧化环境中的氨时所释放的化学能，最终将二氧化碳转化为储存能量的有机物，进行化能合成作用。对异养微生物来说，含C、H、O、N的有机化合物(尿素除外)既可能是碳源，又可能是氮源和能源。5．其他条件：在提供主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对H、O，以及特殊营养物质的需求。比如，培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加维生素：培养霉菌时，需将培养基调至酸性：培养细菌时，需将培养基调至中性或弱碱性：培养厌氧微生物时，需提供无氧的条件。6．培养基配制原则(1)目的明确：不同微生物的生长需求不同，根据培养目的配制培养基。(2)营养要协调：营养物质的浓度和比例要适宜(营养物质过少不能满足微生物生长的营养需要，过多对微生物的生长有抑制作用)。(3)理化性质适宜：控制好培养基的pH、渗透压等方面的性质。(4)经济节约：在配制培养基时应尽量利用廉价且易获得的原料作为培养基成分，特别是在发酵工业中，培养基用量很大，应降低生产成本。必会知识二无菌技术1．无菌技术的关键是防止杂菌污染2．主要内容(1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。(2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。(3)为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在超净工作台并在酒精灯火焰附近进行。(4)实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。3．常用的方法(1)消毒概念常用方法应用范围使用较为温和的物理、化学或生物方法杀死物体表面或内部一部分微生物，不包括芽孢和孢子煮沸消毒法(100℃煮沸5～6min)日常用品巴氏消毒法(62～65℃消毒30mim或80～90℃处理30s～1min)不耐高温的液体(牛奶、果汁等)化学药物消毒法用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等紫外线消毒法(紫外线照射30min)接种室、接种箱或超净工作台(2)灭菌概念常用方法应用范围使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼烧灭菌法(用酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧)。涂布器、接种环、接种针或其他金属用具，试管口或瓶口等干热灭菌(干热灭菌箱，160~170℃，2~3h)耐高温、需保持干燥的物品，如玻璃器皿(吸管、培养皿等)和金属用具等湿热灭菌中的高压蒸汽灭菌法(高压蒸汽灭菌锅，100kPa，121℃，15~30min)培养基、部分塑料制品(枪头、试管等)(1)灼烧接种环的具体过程用酒精灯火焰的充分燃烧层(外焰)灼烧接种环，可迅速彻底地灭菌(1、2、3表示先后顺序)。(2)培养皿是一种用于微生物或细胞培养的实验室器皿，由一个平面圆盘状的底和一个盖组成，一般由玻璃或塑料制成，是专为防止空气中微生物的污染而设计的。(3)高压蒸汽灭菌开始之前，要将锅内的冷空气排尽？灭菌完毕后，要待压力降到0时才能打开排气阀：在同一温度下，湿热的灭菌能力比干热大，在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排出是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。如果在压力未降到0时打开排气阀，会导致锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。(4)选择无菌技术的原则：既要考虑使用的效果，又要考虑无菌操作对象的承受能力；一般情况下，对能灭菌的对象进行灭菌处理，如培养基、培养皿以及接种工具：对不能灭菌的对象进行消毒处理，如操作者的衣着和手等。(5)培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能倒平板。必会知识三微生物的纯培养1．微生物的纯培养(1)培养物：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。(2)纯培养物：由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物。(3)纯培养：获得纯培养物的过程就是纯培养。(4)步骤：配制培养基→灭菌→接种→分离和培养。2．酵母菌的纯培养：酵母菌的纯培养可分成制备培养基、接种和分离酵母菌，培养酵母菌三个阶段。(1)制备培养基①配制培养基：称取去皮的马铃薯200g，切成小块，加水1000mL，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖(也可用蔗糖代替)、15～20g琼脂，用蒸馏水定容至1000mL。②灭菌：将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下灭菌15～30min。将5～8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内在160～170℃灭菌2h。③倒平板：待培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。具体操作过程如下：(2)接种和分离酵母菌：通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面(即平板划线法)。平板划线的具体操作如下：(3)平板划线结果：平板划线示意图及培养后菌落分布示意图如图甲、乙所示。经数次划线培养，可以分离得到单菌落。(4)培养酵母菌：完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右(培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异)的恒温箱中，培养24～48h后，分别观察并记录结果。3．实验注意事项：(1)培养基的放置：平板固体培养基冷却凝固之后，除接种操作过程中应使皿底在下、皿盖在上之外，无论是放置备用还是接种后培养阶段，均应倒置。(2)将未接种的培养基(或接种等量无菌水的培养基)放入28℃左右恒温箱中培养的目的是作为空白对照，若有菌落生长，说明培养基被污染或灭菌不彻底。(3)接种成功的标准：若培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小等基本一致，并符合酵母菌菌落的特点(表面光滑、湿润、黏稠、多为乳白色的圆形菌落)，则说明接种操作是符合无菌要求的：若培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中未达到无菌操作要求，需要分析原因，重新进行实验(4)培养24h与48h后的酵母菌菌落的大小会有明显不同，培养48h后的菌落明显较大，菌落颜色加深，光泽度增强。(5)如果在培养基上观察到了不同形态的菌落，原因可能是菌种不纯培养基灭菌不彻底或在实验操作过程中被杂菌污染(6)在整个微生物培养过程中，要建立“有菌”观念：接种用具、器皿、空气中都充满了微生物，都有污染的可能，必须严格地消毒、灭菌。同时，在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开时一定要洗手，以防被微生物感染。使用过的培养基要经过灭菌处理后才能丢弃，以免污染环境。必会知识四菌种的保藏1．菌种的保藏比较项目临时保藏法甘油管藏法适用对象频繁使用的菌种长期保存的菌种培养基类型固体斜面培养基液体培养基保藏温度4℃－20℃方法菌落长成后将试管放人冰箱中保藏，以后每3~6个月将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上将培养的菌液与等体积灭菌后的甘油混合均匀后放在冷冻箱内保存缺点菌种易被污染或产生变异不适于频繁使用长期保持菌种的优良特性的核心是必须降低菌种的变异率，而菌种的变异主要发生于微生物旺盛生长、繁殖的过程中，因此必须创造一种环境，使微生物处于新陈代谢的最低水平，即生长繁殖不活跃状态。必备技能典例精讲模型秒杀巧思妙解必备技能一培养基的组分及配制[例1](2022·浙江杭州·浙江省杭州第二中学校联考模拟预测)下列有关微生物培养基的配制表述错误的是(

)A．培养硝化细菌的培养基中的铵盐可作为氮源和能源B．尿素固体培养基中的K2HPO4能用于维持培养基的pHC．培养光能自养型的蓝细菌的培养基中不需提供有机物D．马铃薯蔗糖固体培养基中的琼脂能作为酵母菌的碳源必备技能二无菌技术在微生物培养中的应用[例2](2022春·吉林·高二校考期中)消毒和灭菌是微生物培养中常用的操作方法。下列说法正确的是(

)A．微生物接种技术的方法都相同，其核心就是要防止杂菌污染，保证培养物的纯度B．在100℃下煮沸5～6min属于消毒方法，可杀死绝大多数微生物细胞C．在灭菌后倒平板前，加入一定量的缓冲液以调节培养基的pHD．高压蒸汽灭菌，只有当压力表的压力降到一个标准大气压时，才能打开盖子必备技能三微生物的纯培养[例3](2022春·四川自贡·高二自贡市蜀光中学校考阶段练习)某同学用牛肉膏蛋白胨固体培养基进行大肠杆菌纯化培养，下列说法错误的是(

)A．蛋白胨可为大肠杆菌的生长提供碳源、氮源和维生素等营养成分B．在牛肉膏蛋白胨培养基的配制过程中，需灭菌后调节pHC．倒平板操作中，待平板冷却凝固后将平板倒过来放置D．大肠杆菌纯化培养的关键是要防止杂菌的污染必备技能四固体培养基时倒平板[例4](2022春·吉林·高二校考期中)下列关于制备固体培养基时倒平板的叙述，正确的是(

)A．倒好的培养基和培养皿要进行消毒处理B．应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上C．为防止微生物污染，要在酒精灯火焰旁进行操作D．倒好培养基的培养皿，要立即将平板倒过来放置必备技能五以相关科研成果为背景考查微生物的纯培养[例6](2022春·山东德州·高二德州市第一中学校考周测)科研人员尝试利用某种细菌限制蓝藻的数量，相关实验如下图，图中①~⑥表示实验步骤。回答下列问题：(1)从生态系统的营养结构上看，蓝藻处于___________；蓝藻的代谢类型是___________。(2)本实验涉及微生物接种技术，微生物的接种技术有稀释涂布平板法和___________法，本实验步骤②和⑤采用的接种方法为______________________。(3)实验步骤①和④均需振荡培养，步骤①振荡培养的目的是增加培养液中___________的含量，以及增大蓝藻与培养液的接触面积，提高培养基中营养物质的_____________。(4)本实验操作中需要配制固体培养基，即平板。倒平板冷凝后，将平板倒置，既可以防止____________________________________________，又可以避免培养基中的水分快速挥发。培养基的灭菌方法一般为___________________。(5)图中⑤实验组在每个培养皿中，如果做三个重复实验，可采取的做法是______________。为完善实验设计方案，应增设对照组，设计对照组的目的是________________________。必刷好题基础演练能力提升巅峰突破1．(2022春·四川自贡·高二自贡市蜀光中学校考阶段练习)下表所示为某微生物培养基的配方，有关叙述错误的是(

)成分含量成分含量NaNO33gFeSO40.01gK2HPO41g葡萄糖30g琼脂15gH2O1000mLMgSO4·7H2O0.5g青霉素0.1万单位A．依用途划分，该培养基属于选择培养基B．该培养基所培养微生物属于异养型，可以是酵母菌或霉菌C．本培养基中青霉素充当了微生物生长对特殊营养物质的要求D．若用该培养基分离能分解尿素的细菌，应除去青霉素和NaNO3，并应加入尿素2．(2022春·江苏淮安·高二校考阶段练习)下列有关培养基及其制备的叙述中，正确的是(

)A．各种培养基中都含有水、无机盐、碳源、氮源等最基本的物质B．配制完成的培养基一般使用高压蒸汽灭菌锅进行灭菌C．不同微生物对pH要求不同，通常在灭菌后调节其pHD．由于灭菌过程中会导致培养基中水分大量挥发，故灭菌后加适量的水定容3．(2022春·青海西宁·高二统考期末)获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的污染。下列有关消毒和灭菌技术的叙述，正确的是(

)A．牛奶等食品常用巴氏消毒B．紫外线、氯气的消毒属于化学药剂消毒法C．接种针、接种环等金属用具不能使用高压蒸汽灭菌法灭菌D．培养基、玻璃试管常用干热灭菌法灭菌4．(2022秋·山东青岛·高三青岛二中校考期中)在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。相关叙述正确的是(

)A．在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具不可以放入干热灭菌箱中进行干热灭菌B．消毒是用强烈的理化方法杀死物体内外的所有微生物C．配制好培养基后，先高压蒸汽灭菌，后定容D．采用紫外线照射照射消毒前，适量喷洒石炭酸，可强化消毒效果5．(2022春·广东潮州·高二饶平县第二中学校考阶段练习)下列有关微生物培养的叙述中，不正确的是(

)A．获得纯净培养物的关键是防止杂菌污染B．单菌落的分离是消除污染杂菌的通用方法C．菌种和培养基使用前均需灭菌处理D．紫外线照射配合消毒液使用可以加强消毒效果6．(2022春·陕西榆林·高二校考期中)甲、乙、丙是三种微生物，下表I、Ⅱ、Ⅲ是用来培养微生物的三种培养基。甲、乙、丙都能在Ⅲ中正常生长繁殖；甲能在I中正常生长繁殖，而乙和丙都不能；乙能在Ⅱ中正常生长繁殖，甲、丙都不能。下列说法正确的是(

)粉状硫10gK2HPO44gFeSO40.5g蔗糖10g(NH4)2SO40.4gH2O100mlMgSO49.25gCaCl20.5gⅠ+++++++Ⅱ+++++++Ⅲ++++++++A．甲、乙、丙都是异养微生物B．甲、乙都是自养微生物、丙是异养微生物C．甲是异养微生物、乙是固氮微生物、丙是自养微生物D．甲是固氮微生物、乙是自养微生物、丙是异养微生物7．(2022春·四川自贡·高二自贡市蜀光中学校考阶段练习)为宣传“正确佩戴口罩可以降低呼吸道传染病传播风险”，我校生物兴趣小组同学进行了佩戴口罩在说话、咳嗽时传播微生物数量的检测实验。实验中将牛肉膏蛋白胨培养基置于距自己口前方50cm处(如图)，然后对着培养基方向说话1min或咳嗽2次，再进行微生物培养和观察。相关叙述正确的是(

)A．实验中牛肉膏蛋白胨培养基应为液体培养基，要进行严格灭菌处理B．实验中还应该设置“不戴口罩直接说话或咳嗽”进行对照实验C．可以根据菌落数大致推测出活菌数，而菌落数往往大于活菌数D．培养结束后可根据菌落的形状、大小、色泽等特征确定微生物数量8．(2022春·浙江·高二统考阶段练习)人体皮肤表面存在着多种微生物，某同学为观察自然状态下手掌上附着的微生物，将自己的手掌在配制好的LB固体培养基上轻轻按压，然后将平板倒置于恒温培养箱中培养48h，结果如图所示。下列叙述错误的是()A．对配制的培养基需要进行高压蒸汽灭菌B．对手掌需要充分清洗并用75%酒精擦拭消毒C．可通过观察菌落的形态和颜色初步判断微生物的类型D．手掌上的某些微生物未能在该培养基上生长繁殖形成菌落9．(2022秋·河南·高三马店第一高级中学校联考阶段练习)实验室获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，无菌技术操作是防止外来杂菌入侵的重要保证。回答下列问题：(1)无菌技术主要分为消毒和灭菌。消毒是指使用_______仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物﹔灭菌则是指_______。(2)日常生活中经常用到多种消毒方法，如对牛奶和自来水常用_______，对医院病房空间的微生物常用_______。(3)灭菌的方法主要有灼烧灭菌、_______和高压蒸汽灭菌。使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，一般对压力和温度的要求是_______，时间维持