初中生物实验分离纯化淀粉酶教案设计

生物材料中分离纯化淀粉酶教案设计

一、目的和要求

L掌握盐析法初步分离纯化蛋白质的原理和方法；

2.掌握透析脱盐浓缩蛋白质的原理和方法。

3.掌握膜分离原理和方法

二、基本原理

L蛋白质的盐析

蛋白质是亲水胶体，借水化膜和同性电荷(在ph值7.0的溶液中

一般蛋白质带负电荷)维持胶体的稳定性。由于蛋白质分子内及分子

间电荷的极性基团有着静电引力，当向蛋白质溶液中加入少量碱金属

或碱土金属的中性盐类［如(nh4)2so4、na2so4、nacl或mgso4等］时，

由于盐类离子与水分子对蛋白质分子上

的极性基团的影响，使蛋白质在水中溶解度增大，因此蛋白质、

酶等在低盐浓度下的溶解质随着盐液浓度升高而增加，此时称为盐溶;

当盐浓度不断上升并达到一定浓度时，蛋白质表面的电荷大量被中和,

水化膜被破坏，于是蛋白质就相互聚集而沉淀析出，蛋白质和酶的溶

解度又以不同程度下降并先后析出，称为蛋白质的盐析。

由盐析所得的蛋白质沉淀，经过透析或用水稀释以减低或除去盐

后，能再溶解并恢复其分子原有结构及生物活性，因此由盐析生成的

沉淀是可逆性沉淀。盐析法就根据不同蛋白质和酶在一定浓度的盐溶

液中溶解度降低程度的不同而达到彼此分离的方法。盐析法对于许多

非电解质的分离纯化都是适合的，也是蛋白质和酶提纯工作应用最早,

至今仍广泛使用的方法。

2.透析脱盐的原理

蛋白质的分子很大，其颗粒在胶体颗粒范围（直径1〜lOOnm）内，

不能透过半透膜。选用孔径合宜的半透膜，使小分子物质能够透过,

而蛋白质颗粒不能透过，这样就可使蛋白质和小分子物质分开。把蛋

白质溶液装入透析袋中，袋的两端用线扎紧，然后用蒸馈水或缓冲液

进行透析，这时盐离子通过透析袋扩散到水或缓冲液中，蛋白质分子

量大不能穿透析袋而保留在袋内，通过不断更换蒸镭水或缓冲液，直

至袋内盐分透析完毕。这种方法可除去和蛋白质混合的中性盐及其他

小分子物质，是常用来纯化蛋白质的方法。透析需要较长时间，常在

低温下进行，并加入防腐剂避免蛋白质和酶的变性或微生物的污染。

三、试验材料

1.培养基

种子培养基：牛肉膏5g蛋白豚10gnacl5g可溶性淀粉2g葡萄糖

1.5g/1000mlh2o配100ml

发酵培养基：牛肉膏5g蛋白陈10gnacl5g可溶性淀粉2g/1000ml

2.酶活测定溶液

0.2mol/lph6.8pbs缓冲液葡萄糖标准液lmg/mldns试剂（3,5-二硝

基水杨酸试剂）

3.试剂

蛋白腺、牛肉膏、可溶性淀粉、（nh4）2so4、naoh>hcl、、na2hpo412h2o>

nah2Po4h2o、edta

4.仪器或其它用具

微量移液器、移液器枪头、透析袋、恒温培养箱、摇床、紫外检

测仪（分光光度计）、离心机、分析天平、ph计、量筒、250ml瓶、

分装架、记号笔、纱布、酒精灯、灭菌锅、干燥箱、恒温水浴锅等；

四、试验路线

发酵培养好粗酶液制备-硫酸镂盐析玲透析脱盐浓缩玲浓缩酶液

酶活测定

五、操作步骤

1.菌株发酵

将实验一中纯化的菌株接入种子培养基摇瓶培养24h,2%的接种

量接种到发酵培养基，37℃,180r/min,培养36h；

2.粗酶液的制备

发酵液在8000r/min离心20min,收集上清液即为粗酶液，测定酶

活方法参见实验三dns测淀粉酶活力。

3.硫酸镂盐析

3.1盐析条件的确定

40%、60%和80%

盐析步骤

1）发酵液上清分装至3支烧杯中，每个20ml；

2）加硫酸镂至3支烧杯中，对照25℃硫酸钱饱和度配置表，使其

饱和度分别为40%、60%和80%。在加硫酸镂时需缓慢的加入，同时

不断的轻柔搅拌（否则局部浓度过高会使酶失活）使硫酸钱完全溶解;

3）室温静置2h,出现白色沉淀

4）离心，分别取沉淀用少量0.2mol/lph6.8pbs缓冲液回溶。

4.透析脱盐浓缩

4.1透析膜前处理

透析袋的预处理方法：

1）将透析袋剪成合适的长度；

2）在一只250ml的玻璃烧杯中，加入200ml的透析袋处理液，微

波炉中预热；

3）将透析袋装入其中，电炉上煮沸lOmin；

4）用蒸储水彻底洗涤；

5）蒸储水中煮lOmin；

6）冷却后4℃存放，存放过程中透析袋应完全放入0.02mol/l磷酸

酸缓冲液（ph7.0）中

7用细线扎紧透析袋一端，注入清水检验不漏后加入不超过透析袋

体积1/2的须透析溶液。

4.2操作

1沉淀用少量0.2mol/lph6.8pbs缓冲液回溶，移入透析袋中，经透

析膜袋在20倍量0.02mol/l磷酸缓冲液（ph7.0）中在室温，36h透析

脱盐（每过6h换一次透析液）.

2取各梯度脱盐沉淀5ml8000r/min离心20min,取上清测酶活。（沉

淀为变性蛋白质酶活很低。）

5.酶活力的测定

参照实验三中的酶活测定。

实验数据

粗酶液540nm0.2910.314

盐析40%60%80%

1.2212.7081.456

七、实验报告

1.实验结果

（1）测定粗酶液酶活；

粗酶液540nm0.2910.314（取平均值）

酶活力9.705

（2）测定透析后酶液的酶活力

40%60%80%

540nm吸光度1.2212.7081.456

酶活力36.6381.2443.68

2.实验结果分析

通过比较可知在硫酸钱饱和度为60%时分离纯化淀粉酶酶活力最

高。经盐析，透析除盐后酶活力大大提高纯化后的酶活力约为粗酶活

力的4~9倍。

八、注意事项

(1)硫酸核饱和度计算及加入方式：在分段盐析时，加盐浓度一

般以饱和度表示，所需达到饱和度较高而溶液的体积又不再过分增大

时，可直接加固体硫酸筱，其加入量见附表。注意看清是25℃硫酸

钱饱和度表

(2)清洗透析袋内外时，操作过程中应使用镶子或戴手套；

(3)蛋白质溶液用透析法去盐时，正负离子透过半透膜的速度不

同。以硫酸钱为例，nh4+的透出较快.在透析过