大豆茎溃疡病菌检疫鉴定方法 编制说明

1《大豆茎溃疡病菌检疫鉴定方法》编制说明民共和国思茅海关、中华人民共和国宁波海关。主要起草人：吴品珊、雷荣、大豆茎溃疡病菌分为大豆北方茎溃疡病菌（Diaporthecaulivora(Athow&Caldwell)Santos,Vrandecic&Phillips）和大豆南方茎溃疡病菌（Diaporthe），％，目前我国有关大豆茎溃疡病菌检疫鉴定的标准只有两项行业标准，分别是2研究病菌的等温核酸RPA检测等快速检测方法，RPA（重组酶聚合酶扩增多次试验后确定，选用准确和稳定的分离培养、常规PCR、实时荧光PCR、式、内容、术语表达方式等进行了深入的学习，并根据GB/T1.1-2009《标准化3RPA/CRISPR-Cas12a荧光法（孙夕雯、雷荣、吴品珊等，Rapidandsensitivedetectionoftwofungalpathogensinsoybeansuamplification/CRISPR-Cas12amethod）；探针DM-Pro（许忠祥等RPA/CRISPR-Cas12a荧光法特4丛生致密；病菌具浅色至深色圆形的子座，直径小于2在整个培养介质中；子囊壳黑色，球形，大小1柄，大小30~40×4~7(µm)，透明，长圆至椭圆形，双细胞，分隔处稍缢缩，每个细胞具双油球，大×3~4(µm)；病菌的无性态为拟茎点霉Phomopsis×253.3~348.1(µm)，具长而突出的喙，喙长为731.0~1063.0(µm)；子囊大小54.3.2大豆南方茎溃疡PCR、实时荧光PCR扩增和和重组酶聚合酶扩增（RecombinasePolymerase673.2分子检测方法验证81Diaporthecaulivora2Diaporthecaulivora3Diaporthecaulivora4Diaportheaspalathi5Diaportheaspalathi6Diaportheaspalathi7Diaporthehelianthi8Leptosphaerialindquistii9PhytophthorasojaeLeptosphaeriamaculansLeptosphaeriabiglobosa3.2.1大豆北方茎溃疡DiaporthDPCF4（5′-GCCCCCTTGGGGGCCCCCC9bpbp-bp-bp-bp-bp-bp-750250339bp特异性引物DC2F：5'-AGAACCAAGAGATCCGTTGTDC2R：5'-CCGGCGGCCAAGCTA-3'探针DC2Pb：5'-(FAM)-CATTTATGTTTATTTCTCAGAGTTT-(MProbeqPCRSuperMix(北京全式金生物技术股荧光强度（a.u.)荧光强度（a.u.)3循环数反向引物DC-Cas-R：5'-CGACGGDC-crRNA:5'-UAAUUUCUACUCUUGUAGAUCGCCGCAUCAUCACACCUGG-3'DC-Cas-F/DC-Cas-R(10μmol/L)各2.4μL，DNA模板(1~10ng)2μL荧光强度(a.u.)荧光强度(a.u.)y2(3)w,4-11x-10x时间(min)荧光强度（a.u.)荧光强度（a.u.)y41234-10w时间(min)x3.2.1大豆南方茎溃疡DiaportheaspalDM-R3（5'-GCAGGCCGGCCCCCCCAG-3'）min。bpbp-bp-bp-bp-bp-bp-750250394bp实时荧光PCR有两对特异性引物和探针，特异性引物DM1F：5'-AGGCGCACCCAGAAADM1R：5'-TTTTGCTCAGAGTTTCGGTGTAAA-3'探针DM1Pb：5'-(FAM)-TGAACTCATACCTTACTGTTG-(荧光强度（a.u.)®荧光强度（a.u.)456循环数特异性引物DMF：5'-ACCGCCAGGGCDMR3：5'-GCAGGCCGGCCCCCCCA探针DM-Pro：5'-(FAM)-AGGGCCTGCCCTTCT荧光强度（a.u.)荧光强度（a.u.)4循环数5'-UAAUUUCUACUCUUGUAGAUCGCCGCGUCGCCACy440wwCAGTCCACCACGAGACCCCTTGCGTGCAGCCGCCGCGTCGCCACAC-C3spacer-3’荧光强度(a.u.)荧光强度(a.u.)4y564wx