利用RNA干扰技术沉默稻纵卷叶螟几丁质合成酶A基因

利用RNA干扰技术沉默稻纵卷叶螟几丁质合成酶A基因水稻是世界上最重要的粮食作物之一,全球有一半以上的人以稻米为主食,然而,虫害却是造成水稻减产的主要原因之一。稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocismedinalis),俗称卷叶虫,刮青虫、苞叶虫等,属于鳞翅目(Lepidoptera)螟蛾科(Pyralidae),是对水稻危害最为严重的主要害虫之一。几丁质合成酶是昆虫体内几丁质合成通路中最后一个酶,也是关键酶,在昆虫生长发育中具有重要作用,是控制害虫的理想靶标。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。本研究的主要目的是利用体外注射RNAi和转基因RNAi技术,获得对稻纵卷叶螟几丁质合成酶基因具有沉默作用的转基因水稻植株,从而达到控制稻纵卷叶螟危害的目的,为其的生物防治奠定基础。取得的主要研究结果如下:1.稻纵卷叶螟几丁质合成酶A基因的克隆及表达谱采用RT-PCR结合RACE-PCR方法从稻纵卷叶螟中克隆得到几丁质合成酶A基因(CmCHSA)的全长cDNA,其长度为5223bp,包含4695bp的开放阅读框,编码1564个氨基酸。生物信息学分析显示该酶有16个跨膜螺旋区,但无信号肽,等电点为6.63。同源建模预测显示,CmCHSA的三维分子结构中含5个α螺旋,4个β折叠片。氨基酸序列同源性分析表明CmCHSA的氨基酸序列与亚洲玉米螟Ostriniafurnacalis几丁质合成酶A的氨基酸序列一致性最高,高达96%;与甜菜夜蛾Spodopteraexigua、甘蓝夜蛾Mamestrabrassicae和棉铃虫Helicoverpaarmigera等几丁质合成酶A的序列一致性也较高,分别为92%、92%和91%。基因时空表达谱分析表明,CmCHSA在稻纵卷叶螟整个生长发育时期均有表达,在卵中的表达量最低,蛹中表达量最高;CmCHSA在检测的成虫各个组织中都有表达,其表达水平高低顺序为:表皮>头部>肌肉>中肠>卵巢>马氏管>脂肪体>精巢。2.注射dsRNA干扰稻纵卷叶螟几丁质合成酶A基因的表达以稻纵卷叶螟几丁质合成酶A基因为靶标,设计两个RNAi靶位点并将其命名为CmCHSA-Ⅰ和CmCHSA-Ⅱ,在体外合成CmCHSA的两个dsRNA,用显微注射法导入3龄幼虫体内,然后通过表型观察和荧光定量PCR(RT-qPCR)检测干扰效应。结果表明,注射两种dsRNA后纵卷叶螟对水稻的取食明显下降,生长发育阻滞,虫体变小变黑和畸形,有的出现死亡。RT-qPCR表明,注射CmCHSA-Ⅰ和CmCHSA-Ⅱ两种dsRNA在96h后,CmCHSA的表达量相比对照分别下降了59%和64%。注射CmCHSA-Ⅰ和CmCHSA-Ⅱ两种dsRNA7d后,稻纵卷叶螟的死亡率分别为80%和83.33%,与对照组相比,分别增加了66.67%和70%;且各组的校正死亡率为76.92%和80.77%。3.重组RNA干扰植物表达载体的构建与鉴定以CmCHSA-Ⅰ和CmCHSA-Ⅱ两个片段为靶位点,分别在其两端添加BamHI和SpeI酶切位点并进行人工合成,经双酶切后与植物表达载体p1301连接,构建p1301-CmCHSA-Ⅰ*和p1301-CmCHSA-Ⅱ*重组植物表达载体。PCR、双酶切及测序鉴定结果表明重组表达载体p1301-CmCHSA-Ⅰ*和p1301-CmCHSA-Ⅱ*已构建成功,并采用液氮冻融法将其成功转入农杆菌LBA4404,构建基因工程菌。4.转基因水稻的获得及RNA干扰效应检测用含有p1301-CmCHSA-Ⅰ*和p1301-CmCHSA-Ⅱ*质粒的农杆菌LBA4404浸染中花11号粳稻愈伤组织,经过愈伤组织的抗性筛选、分化和植株再生,获得20株转基因再生植株。靶标位点的RT-PCR检测结果表明,6株是含有CmCHSA-Ⅰ*的阳性转基因植株,7株是含有CmCHSA-Ⅱ*的阳性转基因植株。用取食非转基因水稻的稻纵卷叶螟作为对照,观察发现取食每株转基因水稻后纵卷叶螟的生命活性明显下降,生长发育滞后,出现蜕皮受阻,虫体变小、畸形和死亡等情况。用实时荧光定量PCR方法分株测定取食转基因水稻稻纵卷叶螟体内CmCHSA基因的mRNA表达水平,并统计其死亡情况。结果显示,相较于对照组,取食转入目的基因片段CmCHSA-Ⅰ*水稻稻纵卷叶螟CmCHSA基因平均相对表达量相下降了56.8%;取食转入目的基因片段CmCHSA-Ⅱ*水稻稻纵卷叶螟CmC