分子修饰狂犬病ERA疫苗株及表达埃博拉或马尔堡病毒GP重组ERA疫苗株的研究

分子修饰狂犬病ERA疫苗株及表达埃博拉或马尔堡病毒GP重组ERA疫苗株的研究Ⅰ:分子修饰狂犬病毒ERA疫苗株的研究狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabiesvirus,RABV)引起的一种人兽共患病,一旦出现神经症状致死率几乎达100%。全世界每年约60,000人死于该病,超过95%发生在非洲和亚洲。几乎所有的人间狂犬病死亡病例均由犬咬伤或抓伤所传播,而疫苗接种能有效防控狂犬病的肆虐。日益增多的流浪犬、散养家畜和野生动物狂犬病的存在加大了狂犬病流行区人感染狂犬病的风险,针对这些动物进行口服免疫比传统的注射免疫更具有可行性。因此,安全、有效的狂犬病口服疫苗的研发仍具有重要意义。本研究对G333位点突变成谷氨酸(E)的分子修饰狂犬病病毒ERA疫苗株(rERAG333E)进行生物学特性分析,并对其作为犬狂犬病口服疫苗的潜力进行了评价。rERAG333E在BSR细胞上的生长动力学曲线与亲本疫苗株ERA相似,在感染后96h达到最高滴度(108.24FFU/mL),与ERA的最高滴度(108.26FFU/mL)基本一致。rERAG333E分别在乳鼠脑内连续传5代和NA细胞上连续传20代,其G333E突变不发生回复突变,具有遗传稳定性。rERAG333E的体外嗜神经指数(neurotropismindex,NI)为0,不具有体外嗜神经性,而ERA的NI为0.4。将rERAG333E和ERA分别按1×106和1×105FFU/30μL/只的剂量颅内接种感染成年BALB/c小鼠和乳鼠,rERAG333E感染组成年小鼠未见任何明显的狂犬病症状,而rERA感染组成年小鼠14日内全部死亡,表明G333E突变失去了ERA疫苗株对成年小鼠的致病力;rERAG333E和rERA均能致死乳鼠,但rERAG333E感染组乳鼠的死亡进程较rERA感染组推后了2天,表明G333E突变降低了ERA株对乳鼠的致病力。将rERAG333E经肌肉途径接种BALB/c小鼠和比格犬,可诱导显著的RABV中和抗体反应,并对小鼠提供完全的攻毒保护,表明rERAG333E株对小鼠和犬均具有良好的免疫原性。为进一步评估rERAG333E的口服免疫效力,将rERAG333E分别按106、107、108FFU/100μL/只的剂量经口服途径接种小鼠,均可诱导显著、持续1年以上的RABV中和抗体反应,免疫后1年各免疫组小鼠均能获得完全攻毒保护。同时,将rERAG333E分别按108、109FFU/1,000μL/只的剂量经口服途径1次接种或间隔55周2次接种比格犬。结果显示,1次接种组口服接种犬能诱导显著的RABV中和抗体反应,免疫后156周109FFU和108FFU剂量组犬血清RABV中和抗体滴度平均值分别为1.24IU/mL和0.34IU/mL(2/4>0.5IU/mL);2次接种组初次免疫后55周,109和108FFU剂量组犬血清RABV中和抗体滴度平均值分别为1.54IU/mL和2.71IU/mL,加强免疫后能诱导显著的免疫记忆效应,加强免疫后104周109和108FFU剂量组犬血清RABV中和抗体滴度平均值分别为1.80IU/mL和1.61IU/mL;此外,rERAG333E口服免疫后4周109和108FFU剂量组犬唾液RABV特异性IgA转阳率分别为50%(5/10)和60%(6/10)。上述所有免疫犬均未出现任何狂犬病相关症状。本研究结果表明,分子修饰的ERA株rERAG333E对犬具有良好的安全性,能诱导犬产生持续三年以上的中和抗体反应,以及特异性黏膜IgA反应,具有作为犬狂犬病口服疫苗的潜力。Ⅱ:表达埃博拉或马尔堡病毒GP重组ERA疫苗株的研究埃博拉出血热(Ebolahemorrhagicfever,EHF)和马尔堡出血热(Marburghemorrhagicfever,MHF)分别由埃博拉病毒(Ebolavirus,EBOV)和马尔堡病毒(Marburgvirus,MBGV)引起,均为烈性人畜共患病,以发热、急性出血、高发病率和高死亡率为特征。EHF和MHF均能在人间传播,并能感染蝙蝠等多种野生动物和犬、猪等强流动性家畜,该类病一旦发生将造成严重的公共安全问题。到目前为止仍无官方许可的人用EHF和MHF疫苗投入使用,并且通过注射途径免疫野生动物和流动性强的家养动物以清除传染源和切断传播途径显得极其困难。因此,研制有效的EHF或MHF人用灭活疫苗和动物口服疫苗显得尤为紧迫和重要。本研究以狂犬病候选口服疫苗株rERAG333E为活病毒载体,分别构建了表达扎伊尔EBOV(ZEBOV)、苏丹EBOV(SEBOV)或MBGV的野生型GP(wt-G)或密码子优化GP(co-G)的重组病毒rERAG333E/ZGP、rERAG333E/ZGPGCD、rERAG333E/SGP、rERAG333E/SGPGCD、rERAG333E/MGP和rERAG333E/MGPGCD。这些重组RABVs能够正确地表达外源蛋白,并具有与载体病毒rERAG333E相似的BSR细胞生长适应性和稳定性。分别通过将埃博拉相关重组病毒颅内感染成年小鼠和乳鼠及马尔堡相关重组病毒口服和肌肉感染成年小鼠,感染后的成年小鼠均未见任何明显的狂犬病症状,而感染后乳鼠的死亡进程与载体组相似,结果表明EBOV或MBGVGP基因的插入和表达没有增强载体病毒对小鼠的致病力。为评估埃博拉相关重组RABVs对小鼠的免疫原性,将重组病毒rERAG333E/ZGP、rERAG333E/ZGPGCD、rERAG333E/SGP、rERAG333E/SGPGCD和亲本株rERAG333E在小鼠模型上分别口服或肌肉1次接种活病毒或间隔3周2次肌肉接种灭活的病毒培养物。结果显示,埃博拉相关重组RABVs按以上三种不同的途径/剂型免疫接种小鼠,均能诱导持续13周的高水平RABV中和抗体(RABVVNA)和抗ZEBOV或SEBOVGP假病毒中和抗体(ZEBOV或SEBOVVNA)反应。此外,重组RABVs分别经以上三种途径/剂型免疫接种小鼠均能诱导产生抗ZEBOV或SEBOVGP的IgG和IgG2a反应;与活病毒和灭活病毒肌肉接种组相比,口服接种组小鼠血清中的IgG水平略低,但IgG2a维持在相似的水平。分别表达EBOVwt-G或co-G的重组RABVs经以上三种不同的途径/剂型接种小鼠,诱导的RABV、ZEBOV或SEBOVVNA反应及相应的IgG及IgG2a水平无显著差异。结果表明,重组病毒rERAG333E/ZGP、rERAG333E/ZGPGCD、rERAG333E/SGP和rERAG333E/SGPGCD经口服接种活病毒或肌肉接种灭活病毒均具有良好的免疫原性。为评估马尔堡相关重组RABVs对小鼠的免疫原性,将重组病毒rERAG333E/MGP、rERAG333E/MGPGCD和亲本株rERAG333E在小鼠模型上分别口服或肌肉1次接种活病毒或间隔3周2次肌肉接种灭活的病毒培养物。结果显示,rERAG333E/MGP和rERAG333E/MGPGCD按三种不同的途径/剂型免疫接种小鼠,均能诱导高水平的RABVVNA反应和抗MBGV假病毒中和抗体反应(MBGVVNA);初次免疫后5周能完全保护所有免疫小鼠抵抗致死量RABV街毒株GX/09的攻击;分别表达MBGVwt-G或co-G的重组RABVs经以上三种不同的途径/剂型免疫小鼠,诱导的RABV和MBGVVNA水平无显著差异。结果表明,重组病毒rERAG333E/MGP和rERAG333E/MGPGCD经口服接种活病毒或肌肉接种灭活病毒均具有良好的免疫原性。本研究结果表明,重