《内含子的比较》课件

8.5不同类型内含子的比较内含子类型细胞内定位GU-AG,GC-AG,AU-AC细胞核I类细胞器，细菌，低等真核生物细胞核中II类细胞器，细菌双内含子细胞器tRNA前体中的内含子细胞核1精选课件ppt8.5不同类型内含子的比较内含子类型细胞内定位GU-AG,8.5.1.1Ⅰ型内含子概念:：1980年代初，发现原生动物四膜虫(Tetruhymenu)的rRNA内含子能够自我剪接(selfsplicing)，这一类内含子后被称作Ⅰ型内含子.后来在酵母菌的线粒体rRNA基因中也含有此类内含子.2精选课件ppt8.5.1.1Ⅰ型内含子概念:：1980年代初，发现原生发现过程为:1980年,科学工作者将四膜虫rRNA基因克隆到质粒中，并与E.coli

的RNA聚合酶一起保温，发现转录产物除了有约400nt的rRNA内含子外，还有一些小片段。从凝胶中回收rRNA前体，在无蛋白质的条件下保温培养，单一的rRNA前体依然可形成片段更小的电泳条带，其中移动最快的是39nt的条带，测序发现，它相当于413nt的rRNA内含子中的片段。将四膜虫26SrRNA基因的一部分(第l个外显子303bp+完整的内含子413bp+第2个外显子624bp)克隆到含噬菌体SP6启动子的载体内，再转录该重组质粒，将获得的产物与GTP一起保温，可以得到剪接产物，但缺乏GTP时无剪接反应，证明rRNA前体的确可以进行有GTP参与的自我剪接。3精选课件ppt发现过程为:3精选课件ppt8.5.1.2Ⅰ型内含子的剪接机制

(1)I型内含子剪接的过程

I型内含子剪接的第一次转酯反应，是由一个游离的鸟苷或鸟苷酸(GMP,GDP或GTP)启动的。鸟苷酸或鸟苷的3'-OH亲核攻击内含子5'-端剪接点的磷酸二酯键，将G转移到内含子的5'-端，同时切割内含子与上游外显子之间的磷酸二酯键，在上游外显子末端产生新的3'-OH。在第二次转酯反应中，上游外显子3'-OH攻击内含子3'-端剪接点的磷酸二酯键，将上游外显子和下游外显子连接起来，并释放线性的内含子。两次转酯反应是连续的，即外显子连接和线性内含子的释放同时进行。因此，实验不能得到游离的上游外显子和下游外显子。4精选课件ppt8.5.1.2Ⅰ型内含子的剪接机制(1)I型内含子剪接5精选课件ppt5精选课件ppt

第三次转酯反应是线性内含子的环化，发生在已切除的内含子片段中，内含子的3'-OH攻击其5'-端附近的第15和第16核苷酸之间的磷酸二酯键，从5'-端切除15nt的片段，并形成399nt的环状RNA。环状RNA随即被切割生成线状RNA，由于切割位置与环化位置相同，生成的线状RNA依然为399nt。接着，再从5'-端切去4个核苷酸，最终产物是395nt的线性RNA，由于这一产物比最初释放的内含子少19个核苷酸，因而被称作L19。6精选课件ppt6精选课件ppt(2)I型内含子的结构I型内含子剪接的最重要特点是自我催化(self-catalysis)，I型内含子的自我剪接活性依赖于RNA分子中的碱基配对。通过比较不同的I型内含子序列，发现其中有9个主要的碱基配对区域，命名为P1～P9，在I型内含子中高度保守的双链结构有3个，即P1的内部引导序列(internalguidesequence,IGS)，P4的保守短序列元件P/Q，和P7的保守短序列元件S/R，其他配对区的序列因内含子不同而异。I型内含子自我剪接所需的最小催化活性中心由P3、P4、P6和P7组成。该结构包括由两个结构域构成的催化核心，每个结构域由两个碱基配对区域构成。包含上游外显子末端序列和内含子端IGS的P1，构成底物结合位点，IGS是内含子中能与外显子进行碱基配对的序列，这种配对使剪接位点暴露而易受攻击，同时使剪接反应具有专一性(图8-16)。7精选课件ppt(2)I型内含子的结构I型内含子剪接的最重要特点是8精选课件ppt8精选课件pptI型内含子的特征1.边界顺序为5′U……G3′;2.具有中部核心结构（Centralcorestructure);3.内部引导顺序(InternalguideseguenceIGS);4.剪接通过转酯反应（Transesterification).9精选课件pptI型内含子的特征9精选课件ppt8.5.2.1II型内含子的特点

II型内含子主要存在于某些真核生物的线粒体和叶绿体rRNA基因中，也具有催化功能，能够完成自我剪接.几乎所有的细菌II型内含子能够编码逆转录酶，并可作为逆转录转座子，或逆转录转座子的衍生物高频率插入特定区域，或低频率插入其它区域。II型内含子是由内含子靠近3'-端的腺苷酸2'-羟基攻击5'-磷酸基启动剪接过程，经过两次转酯反应连接两个外显子，并切除形成套索结构的内含子(图8-17)。10精选课件ppt8.5.2.1II型内含子的特点10精选课件pp11精选课件ppt11精选课件ppt8.5.2.2II型内含子的剪接机制

II型内含子的5'-端和3'-端剪接位点序列为5'↓GUGCG……YnAG↓3'，符合GU…AG规则。II型内含子的空间结构保守而复杂，其自我剪接的活性有赖于其二级结构和进一步折叠的构象，因此在细胞内的存在受到限制。在II型内含子特有的二级结构中，有6个茎环结构形成的结构域(dl～d6)，在空间上靠近的d5和d6，构成催化作用的活性中心(图8-18)。12精选课件ppt8.5.2.2II型内含子的剪接机制

II型内含子13精选课件ppt13精选课件ppt

在II型内含子剪接过程中，首先由内含子靠近3'-端d6结构中的分支点保守序列上A的2'-OH向5'-剪接位点的磷酸二酯键发动亲核攻击，形成外显子1的3'-OH，内含子5'-端的磷酸基与分支点A的2'-OH基形成2',5'-磷酸二酯键，产生套索结构，完成第一次转酯反应。接着，外显子1的3'-OH亲核攻击3'-剪接位点，切断3'-剪接位点的磷酸二酯键，并形成外显子1与外显子2之间的3',5'-磷酸二酯键，完成第二次转酯反应。经过两次转酯反应，两个外显子被连接在一起，并释放含有套索结构的内含子。14精选课件ppt在II型内含子剪接过程中，首先由内含子靠近3'-端d6结构II型内含子主要的转座事件是归巢(homing)，归巢的实质是以内含子RNA作为模板，将逆转录合成的DNA插入靶位点。逆转录反应由与RNA内含子结合的RT催化，属于靶位点为引物的逆转录(target-primedreversetranscription)。如图8-20所示，归巢反应开始于双链DNA外显子连接点上RNA内含子在靶位点的反拼接(reversesplicing)插入，这一步由RNA催化，RT协助，相当于由成熟酶协助的拼接反应的逆反应。随后，RT的En结构域在下游9bp～10bp的位置切开DNA的另一条链，再由RT催化，以被切开的DNA链作为引物进行逆转录反应。最后，通过DNA的修复合成和连接完成内含子的插入过程。15精选课件pptII型内含子主要的转座事件是归巢(homing)，归巢的实16精选课件ppt16精选课件pptSplicingreleasesamitochondrialgroupIIintronintheformofastablelariat.17精选课件pptSplicingreleasesamitoch8.5.3

内含子剪接机制的比较

从内含子的剪接机制来看，I型内含子、II型内含子和核pre-mRNA剪接的III型内含子是相似的，只有tRNA的IV型内含子剪接机制完全不同。I型内含子剪接与核Pre-mRNA剪接体切除内含子的主要区别是，剪接体内含子使用内含子自身的一个核苷酸，而I型内含子的剪接反应使用外源核苷酸，即鸟苷酸或鸟苷，因此在剪接过程中不能形成套索结构。III型内含子的剪接体内snRNA的整体形态和II型内含子自我剪接时的形态类似，特别是剪接体的snRNA和II型内含子的催化部位之间的结构和功能十分相似。可以认为，这些snRNA可能来自早期自我剪接系统的II型内含子18精选课件ppt8.5.3内含子剪接机制的比较

从内含子的剪接机制I型内含子与II型内含子都能够完成自我剪接，不像III型内含子那样需要结构复杂的剪接体。正因为如此，I型内含子与II型内含子剪接的效率和调控远远比不上III型内含子。I型内含子的剪接反应使用外源鸟苷酸或鸟苷，II型内含子的转酯反应无需游离鸟苷酸或鸟苷的启动，由内含子内部的腺苷酸引起，也许II型内含子剪接的效率和精确度比I型内含子更好一些。19精选课件pptI型内含子与II型内含子都能够完成自我剪接，不像I20精选课件ppt20精选课件ppt8.6核酶

8.6.1核酶的发现

1982年Cech等研究原生动物嗜热四膜虫rRNA的转录后加工，发现rRNA的前体可以在鸟苷与镁离子存在下切除自身的内含子，将两个外显子拼接为成熟的rRNA分子，该反应不需要任何蛋白质类型的酶参与，因此Cech认为该rRNA前体具有催化功能，并将其命名为核酶(ribozyme).Cech和Altman因发现Ribozyme而获得1989年度诺贝尔化学奖。21精选课件ppt8.6核酶

21精选课件ppt

1985年Cech等通过进一步研究，从切除的内含子中分离得到L19RNA，可参与如转核苷酸反应、水解反应、转磷酸反应等。L19RNA催化的转核苷酸反应如图8-21所示，可以看出，L19RNA既可从寡聚C切除核苷酸(图8-21①和②)，也可在寡聚C上添加核苷酸(图8-21③和④)，其催化过程具备酶的所有基本特征。22精选课件ppt22精选课件ppt23精选课件ppt23精选课件ppt

核酶作用的特点：1，化学本质RNA2，底物RNA肽键α-葡聚糖分子酶3，反应特异性4，催化效率低5，产物24精选课件ppt24精选课件pptReactionscatalyzedbyRNAhavethesamefeaturesasthosecatalyzedbyproteins,althoughtherateisslower.TheKmgivestheconcentrationofsubstraterequiredforhalf-maximumvelocity;thisisaninversemeasureoftheaffinityoftheenzymeforsubstrate.Theturnovernumbergivesthenumberofsubstratemoleculestransformedinunittimebyasinglecatalyticsite.25精选课件pptReactionscatalyzedbyRNAhav核酶的分类26精选课件ppt核酶的分类26精选课件ppt8.6.3

核酶的结构

核酶的催化功能与其空间结构密切相关，已知有多种不同结构的核酶。例如，I型和II型自我剪接内含子、锤头型、RNaseP的MlRNA、发夹型、丁型肝炎病毒(hepatitisdeltavirus,HDV)的基因组和反基因组等。锤头型、发夹型和HDV正负链核酶均能促使自身或底物RNA裂解，产生2',3'-环磷酸酯和5'-OH

27精选课件ppt8.6.3核酶的结构27精选课件ppt锤头结构(hammerhe