细菌耐药研究的进展及对策1

关于细菌耐药研究的进展及对策[1]000405chmjampc1000405chmjampc2抗生素时代细菌耐药性的问题“ThewarofHumanVsBacteria”Whowillbethelastwinner？“生命总会找到出路”摘自“失落的世界”第2页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc31940-1960年 青霉素时代 1953年耐药率达80%1960-1978年 广谱青霉素和1,2代 1970s出现携带多种耐药基因的菌株 头孢菌素时代 产头孢菌素酶的不动杆菌广泛流行

1978-1995年 广谱

-内酰胺类时代 细菌产超广谱

-内酰胺酶(ESBLs和 第3，4代头孢菌素 BushI型

-内酰胺酶，细菌对三代 单环

内酰胺类 头孢菌素和单环

内酰胺类耐药

-内酰胺酶抑制剂 碳青霉素类1995-2000年 ？？ 全球范围内产诱导酶的肠杆菌对 头孢他啶和头孢噻肟的耐药率高 达20-70%控制细菌耐药不能单纯依靠研制和开发新型抗生素MedeirosAA,etal.ClinInfectDis.1997;24(Suppl):S19-45SentryStudy2000

-内酰胺类抗生素及其耐药菌发展史第3页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc4第第

三三

代头孢菌素代头孢菌素过度使用后过度使用后的的选择作用选择作用G-G-G+G+产产

ESBLESBL

的的大肠杆菌，肺炎克雷大肠杆菌，肺炎克雷伯菌伯菌

等等高产高产

AMPCAMPC

酶酶的的肠杆菌属菌，枸橼肠杆菌属菌，枸橼酸菌，沙雷氏菌等酸菌，沙雷氏菌等MRSAMRSA，，VREVRE，，PRPPRSP对第三代，及第对第三代，及第四代头孢菌素等四代头孢菌素等耐药耐药对第三代头孢菌素及对第三代头孢菌素及酶抑制剂复合制剂酶抑制剂复合制剂耐药耐药碳青霉烯类抗生素碳青霉烯类抗生素

碳青霉烯类抗生素，碳青霉烯类抗生素，第四代头孢菌素第四代头孢菌素

万古霉素万古霉素第4页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc5耐万古霉素肠球菌和金葡菌。耐青霉素肺炎链球菌。多重耐药的结核菌。产ESBLs和AmpC酶菌多重耐药的嗜麦芽窄食单胞菌。多重耐药的绿脓杆菌。人类征服耐药将面临着长期艰巨的任务。根本的办法是合理有效使用抗生素，加强耐药菌的分子流行病学监控，及时阻断耐药菌传播第5页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc6细菌耐药机制1. 产生灭活酶：1)

内酰胺酶(最大的一类)2) 氨基甙钝化酶等2. 靶位改变:PBP的数量或结构改变3.低通透性屏障作用1) 膜通透性下降2) 生物被膜4. 主动泵出(activeeffluxprocess)5. 细菌缺乏自溶酶，对抗菌药物产生耐受第6页,共70页，2024年2月25日，星期天000405蛋白通道：

绿脓杆菌、克雷伯菌属、在细菌细胞外膜，不同药物有各自不同的通道，药物通过时通道可关闭。

脂多糖细胞外膜、细胞壁细胞膜OprD2第7页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc8绿脓杆菌

药物渗透屏障耐药

天然对抗生素的通透性降低，比大肠杆菌的抑菌浓度高数十或数百倍：

大肠杆菌 绿脓杆菌庆大 <1 4-8

吡肟 0.12 1–8

环丙 0.01 0.25-2

外膜蛋白高频突变，抗生素屏障作用增强第8页,共70页，2024年2月25日，星期天000405主动外排作用(反泵作用)：

将范围极其广泛的结构不相关的抗生素或其他有毒物质排出细胞外，以减少药物在细胞周质的积累，从而使细菌产生固有耐药性。

1.经典:细胞质细胞周质

2.穿过细胞内膜及外膜2细胞外膜、细胞壁细胞膜1第9页,共70页，2024年2月25日，星期天000405绿脓杆菌有多药泵出系统，至少有17种多药泵

常见4种外排系统：

MexAB-OprM，MexXY-OprM，MexCD-OprJ，MexEF-OprN

1.绿脓杆菌MexA（连接蛋白）,MexB（转运蛋白）-OprM（外膜通道）外排系统。

药物药物细菌泵（绿脓荧光素.环丙沙星.四环素.氯霉素。与抗生素多重耐药有关）第10页,共70页，2024年2月25日，星期天0004052.绿脓杆菌MexC,MexD-OprJ外排系统。

药物药物细菌泵（b-内酰胺类）第11页,共70页，2024年2月25日，星期天0004053.绿脓杆菌MexE,MexF-OprN外排系统。

药物药物细菌泵（与抗生素多重耐药有关）第12页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc13绿脓杆菌外膜泵的表达和抗生素的耐药性菌株泵 MIC(ug/ml)

PAM MexABMexBCMexEF

LevoFepCpoCarbAztr1275---------0.03

0.1250.250.50.251020(wt)+ --- --- 0.1250.516421032+++------1

44256161438 ++++++--- 2.0 416256162281+++---- +++ 4-844256162303 +++ ++++++4-8481288ModifiedfromLeeet.alJ.Bacteriol2000第13页,共70页，2024年2月25日，星期天000405生物膜形成：

绿脓杆菌克雷伯菌属细菌形成黏液样物质（藻酸盐）保护细菌不受药物作用且避免吞噬细胞吞噬，长期潜伏在病灶处。藻酸盐

绿脓杆菌第14页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc15生物被膜的耐药机制1.弥散屏障2.延缓生长3.各区域生物被膜细胞不同耐药基因的表达第15页,共70页，2024年2月25日，星期天000405

靶位蛋白的改变

耐药金葡、耐药表葡、耐药肺炎链球菌的膜青霉素结合蛋白（PBPs）结构改变，并与-内酰胺药物亲合性下降。PBPs是合成细胞壁终末阶段的酶。MRSA:PBP2aDRSP:PBP改变（PBP1aPBP1bPBP2xPBP2aPBP2bPBP3）敏感菌和耐药菌基因整合使之在种属间水平传播造成大流行。第16页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc17内酰胺酶---最主要的灭活酶1. 到目前已发现200多种；2. 新的种类不断发现；3. 对内酰胺类抗生素造成威胁。第17页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc18B-内酰胺酶分类按结构 功能 活性 棒酸[Ambler][Bush]头孢噻肟 氨曲南 IMP抑制

A 2a - - - ++ 2b - - - ++

2be ++ ++ - ++ 2br - - - - 2c - - - + 2e ++ ++ - ++

.2f+ ++ ++ +

C1 + + - - D 2d - - - +/- ? 4 v - - -

B 3 ++ - ++ -第18页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc19针对内酰胺酶的对策1. 侧链加笨重的基因(Bulkychain)：一代三代2. 复合制剂：酶抑制剂只解决了部分问题3. 发现新的抗菌药物---碳氢酶烯类等4. 正确使用抗菌药物第19页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc20第第

三三

代头孢菌素代头孢菌素过度使用后过度使用后的的选择作用选择作用G-G-G+G+产产

ESBLESBL

的的大肠杆菌，肺炎克雷大肠杆菌，肺炎克雷伯菌伯菌

等等高产高产

AMPCAMPC

酶酶的的肠杆菌属菌，枸橼肠杆菌属菌，枸橼酸菌，沙雷氏菌等酸菌，沙雷氏菌等MRSAMRSA，，VREVRE，，PRPPRSP对第三代，及第对第三代，及第四代头孢菌素等四代头孢菌素等耐药耐药对第三代头孢菌素及对第三代头孢菌素及酶抑制剂复合制剂酶抑制剂复合制剂耐药耐药碳青霉烯类抗生素碳青霉烯类抗生素

碳青霉烯类抗生素，碳青霉烯类抗生素，第四代头孢菌素第四代头孢菌素

万古霉素万古霉素第20页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc21ESBLs的发现和流行1982年英国发现一株耐头孢他啶的产酸克雷 伯菌，与TEM-1相比仅有一个氨基酸的差异1983年德国发现首例ESLBs的臭鼻克雷伯菌(SHV-2)，与SHV-1相比，仅有一个氨基酸的差异1992年法、英、葡医院分离出的KP中有14%~16%产ESBL，而在EC中的比例仅为0.1%第21页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc22ESBLs的发现和流行1992~1996，美国一医院的EC和KP的检出率分别为1%和4%；1996年另两家医院ESBL的检出率分别是35%和42%ESBL除南极洲外均有发现。欧洲以TEM-3为主，美国以TEM-10,12,16为主，而SHV-2,5似乎世界内流行1997年瑞士发现SHV亚型韩国报道存在产SHV-11,2的细菌90年代以来，已成为全球性问题第22页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc23ESBLs的发现和流行香港：90年：ECO(1.6%)KL-(2.8%)EN-(24.1%) 95年：ECO(2.6%)KL-(10.8%)EN-(22.7%)广州：95年：ECO，KPN(5%，ICU，默沙东)96年：ECO(18%)KPN(19%)EN-(16%)98年：ECO(40%)KPN(38%)EN-(38%)

2000年后？第23页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc24

北京：CTX-M-3，11上海：CTX-M-3广州：CTX-M-3，11杭州：CTX-M-3，9，13，14，15，22

中国ESBL的主要基因型第24页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc25ESBL基本概念细菌一旦产生此类酶，临床上对所有青霉素类、头孢类和单酰胺类抗生素耐药，而对碳青霉烯类和头霉烯类较为敏感对酶抑制剂敏感第25页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc26ESBLs的基本概念主要由克雷伯菌和大肠埃希菌产生；为丝氨酸蛋白酶衍生物，水解内酰胺环体外试验：对三代头孢和氨曲南抑菌环缩小，但不一定在耐药范围加入克拉维酸可使抑菌环扩大临床对内酰胺类耐药，对碳青霉烯类和头霉烯类药物敏感由质粒介导，往往由普通的内酰胺酶基因(TEM-1、TEM-2、SHV-1)突变而来，能水解氧亚氨基-b-内酰胺抗生素，目前已有1百多种，多重耐药第26页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc27ESBLs的靶抗生素头孢泊肟(cefpodoxime)(CPD)*安曲南(aztreonam)(ATM)头孢他啶(ceftazidime)(CAZ)头孢噻肟(cefotaxime)(CTX)头孢曲松(ceftriaxone)(CRO)第27页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc28ESBLs的代表性菌株大肠埃希菌肺炎克雷伯菌粘质沙雷菌弗劳地枸橼酸菌阴沟肠杆菌铜绿假单胞菌等第28页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc29广谱酶(TEM-1，TEM-2，SHV-1)主要灭活青霉素和窄谱头孢菌素(一、二代头孢)，三代头孢菌素对其稳定

ESBLs能分解三代头孢(头孢噻肟、头孢他啶、头孢哌酮、头孢曲松)以及单环酰胺类的氨曲南，但大多数产ESBLs菌株对复合制剂(如特治星、舒普深)敏感，几乎所有产ESBLs菌株对泰能敏感产ESBLs菌株的耐药特点第29页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc30

头孢他啶可以选择出产生ESBLs的菌株产生ESBL的病人53%曾经在前一个月使用过头孢他啶在ESBL爆发流行之前头孢他啶的用量是以前的六倍头孢他啶治疗中性粒细胞减少性发热的儿科肿瘤病房发生ESBL爆发流行

AnnInternMed1993选择产生ESBLs的危险因素第30页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc31

ESBL基因型已经发现了150多种TEM 65SHV 38OXA 15CTX-M 23其他型 10第31页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc32产ESBL的大肠杆菌、克雷伯菌的敏感性*抗生素 大肠杆菌

克雷伯菌属

ESBL(+) ESBL(-) ESBL(+) ESBL(-)菌株数 71 172 44 106泰能 100 100 100 100美唑 88 92 94 86西叮 70 83 86 60他啶 76 95 90 97吡肟 89

94

88

97氨曲南 9 93 21 90噻肟 1 91 0 89曲松 2 93 0 93*数据来源于协和医院ddstmethod第32页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc33产ESBL大肠、克雷伯的敏感性*（%）抗生素 Eco.

Kpn

ESBL(+) ESBL(-) ESBL(+) ESBL(-)菌株数 71 172 44 106

阿米 85 94 82 99舒普深 19 94 42 95派拉 0 35 0 63特治星 56 89 79 91特美叮 7 63 20 83环丙 20 44 75 86*数据来源于协和医院第33页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc34ESBLs检测、判断和临床辨认第34页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc35ESBLs检测的原理和方法ESBLs能水解三代头孢及氨曲南酶抑制剂能抑制ESBLsESBLs的检测方法

双纸片法、三维试验法、肉汤稀释法、Vitek-AMS法、E-test法、抑制剂增强的纸片扩散法和肉汤稀释法第35页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc36DefinitionbyNCCLSin2001Diminishedzones,whichshouldbesuspectedofharboringanESBL,around:Ceftazidime ≤22mm，Cefpodoxime ≤22mm,Aztreonam ≤27mmCefotaxime ≤27mm，ceftriaxone ≤25mmThesezonediametershouldincreaseinthepresenceofclavulanicacid第36页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc37查K.Pneumoniae,K.oxytoca&E.coli菌中的ESBLs（初步筛选法)

培养基：CAMHB抗生素浓度： 琼脂内头孢泊肟 1ug/mlor头孢他啶 1ug/mlor氨曲南 1ug/mlor头孢噻肟 1ug/mlor头孢曲松 1ug/mlor使用2种以上的抗生素可以提高检测的敏感性第37页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc38第1级方法第38页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc39产ESBL大肠、克雷伯的敏感性*（%）

进一步分析双纸片协同法:圆心间距离：20mm25mm30mm距20~30mmCTXAugmentin第39页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc40产ESBL大肠、克雷伯的敏感性*（%）

进一步分析纸片确证法CAZ，CAZ+ClavCTX，CTX+ClavCTXCTX+Clav两圈差距>=5mm814第40页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc41第2级方法第41页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc42产ESBL大肠、克雷伯的敏感性*（%）

进一步分析MIC确证法加棒酸后MIC降低8倍,16/2＝8

.12.25.512481632ug/ml＝不长＝长第42页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc43

Etest法(头孢噻肟+克拉维酸噻肟)

1：8头孢噻肟+克拉维酸噻肟MIC=0.5MIC=4.0第43页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc44第3级方法第44页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc45鉴定大肠杆菌及肺炎克雷伯菌中的beta-内酰胺酶的流程

Sanders,AAC，1999，43(6):1393-1400. MIC值(ug/ml)产酶类型 噻肟 噻肟/棒酸 曲松 曲松/棒酸 临床验证非ESBL <2 22/22OBL非ESBL

>2 <0.5

1/36ESBLESBL >2 降>8倍 36/36

ESBL. >2 >0.5 降>8倍 36/36ESBL

第45页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc46鉴定肠杆菌、枸橼酸杆菌中的beta-内酰胺酶的流程Sanders,AAC，1999，43(6):1393-1400.MIC值(ug/ml) 临床验证产酶类型 头孢曲松 曲松/棒酸

其他B-内酰胺酶 <=4 14/15非ESBLESBL >8 降>8倍 15/16ESBL 第46页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc47ESBLs的辩认:耐药性特点肠杆菌科细菌，尤其大肠,克雷伯菌对一个或多个三代头孢敏感性下降常伴有氨基甙,喹诺酮协同耐药头孢呋新耐药酶抑制剂,头孢西丁部分有效亚胺培南敏感临床治疗效果不好第47页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc48ESBLs的治疗对策(1)头孢菌素：(1) 三代头孢菌素：CTX和CAZ耐药率高.(2) 四代头孢菌素：耐药率不很高，对部分ESBLs（如CTX型）稳定。

第48页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc49ESBLs的治疗对策(2)头霉素类和碳氢霉烯类：ESBLs虽然不能水解头霉素FX，但MIC90值为≥256

g/ml，耐药率为16%，可能是由于细菌外膜孔蛋白的缺失造成的。所有产ESBLs和非产ESBLs细菌对IP敏感，证实了碳氢霉烯类是目前对产ESBLs细菌最稳定的内酰胺抗菌药物。第49页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc50ESBLs的治疗对策(3)含酶抑制剂的复合制剂：耐药率较低，分别为8%和2%，但中度敏感率较高，分别为22%和28%，可能是这些细菌同时产生一定量的TEM-1和SHV-1而造成对复合制剂耐药程度的增加。在用复合制剂来治疗产ESBLs细菌感染时需适当增加剂量。近年来对酶抑制剂耐药的ESBLs的出现对复合制剂构成威胁，需开发新抑制剂。第50页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc51ESBLs的治疗对策(4)喹诺酮类和氨基糖甙类

产ESBLs细菌对AK的耐药率达42%，对CI的耐药率更高，达70%，说明这两类药物不适于产ESBLs菌株感染的治疗，除非有药敏资料证实是敏感的，且只能联合用药。第51页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc52

ESBL(＋)菌株的治疗建议加酶抑制剂的复合药：哌拉西林/三唑巴坦头孢哌酮/舒巴坦 严重感染碳青霉烯类：美罗培南，亚胺培南头孢吡肟和头孢他啶体外显示敏感，国外证明头孢吡肟临床疗效和细菌清除率>80%，数据2003年NCCLS将修改。三代头孢菌素、头霉素类是不安全的，不适于产ESBL菌株感染的治疗；阿米卡星和环丙沙星不适于产ESBLs菌株感染的治疗，尤其是环丙沙星，除非体外药敏实验证明是敏感的

第52页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc53ESBL的临床预后高死亡率

在一项儿童肿瘤患者的研究中，由产ESBLs细菌所致的感染引起或直接导致了15%的患者死亡。在一次医院内爆发流行，在可提供治疗及预后资料记录的患者中的初步死亡率达53%高比例持续性定殖

在一群已定殖产ESBL菌株数月的儿童肿瘤患者中，重新筛选检查发现其中60%患者持续出现无症状性细菌尿第53页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc54

AmpC酶由ampC基因编码产生，ampC基因表达同时受ampD，ampR，ampG等多种基因调控，是头孢菌素酶的代表酶，属于染色体Bush1型酶或AmblerC类酶。常见的易产AmpC酶的细菌：阴沟肠杆菌，产气肠杆菌粘质沙雷菌 弗劳地枸橼酸杆菌,摩根摩根菌绿脓杆菌什么是AmpC酶？第54页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc55AmpC酶水解以下抗生素：青霉素类 耐药头霉素类 耐药1,2,3代头孢菌素类 耐药 单环类 耐药加酶抑制剂复合药（克拉维酸，舒巴坦，他唑巴坦）耐药可分为诱导型，结构型和质粒型。

什么是AmpC酶？第55页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc56头孢菌素酶诱导型+

-AmpR激活子ampC激活转录AmpC-lactamasPBPsAmpG感受器或跨膜转运阻断细胞壁五肽交联桥（肽聚糖片断）中间产物（配体）AmpD循环利用内膜外膜第56页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc57+

-AmpR激活子ampC激活转录去阻遏持续高产或高度诱导型AmpC-lactamasPBPsAmpG阻断细胞壁五肽交联桥（肽聚糖片断）中间产物缺陷AmpD蛋白

内膜外膜调节基因ampD突变头孢菌素酶结构型第57页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc585种抗生素对60株耐头孢他啶的

肠杆菌属和枸橼酸杆菌属的活性S%第58页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc596种抗微生物药对

109株肠杆菌属的活性药名 敏感％ 耐药％MIC50MIC90

亚胺培南100 0 0.324头孢吡肟 896 0.38 12头孢哌酮/舒巴坦69 16 296头孢他啶64 28 2 512 头孢曲松5535 2512哌拉西林 51 46 16 512

YingchunXu,MinjunChenetal.DiagnMicrobiolInfectDis1999;35:135-142

第59页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc6014株阴沟肠杆菌耐药株对10种抗生素的MIC（g/ml）

菌株 哌拉 哌唑 噻肟 曲松 他啶 曲南 吡肟 亚培 庆大 1 64 16 32 128 128 32 0.25 0.5 0.5

2 512 64 256 256 128 128 4 0.125 0.5

5 128 64 128 128 128 64 4 2

32 6 64 32 64 64 128 64 0.5 0.125 0.5

8 512 64 256 512 256 64 4 0.125 0.5

13 512 64 256 256 256 64 4 0.125 0.5

14 256 32 128 256 128 64 2 0.125 0.5

18 256 64 128 128 128 64 4 0.25 0.25

19 128 16 64 256 128 32 0.5 0.25 4

20 128 32 256 256 128 32 2 0.125 1

23 512 128 128 256 256 64 4 0.25

32 24 128 16 128 256 128 64 0.5 0.25 0.25

25 256 64 128 256 128 64 2 0.25 0.25

27 512 128 256 512 256 128 4 0.25 0.25

ESBLAmpC－ ＋－ ＋－ ＋－ ＋－ ＋－ ＋－ ＋－ ＋－ ＋－ ＋－ ＋－ ＋－ ＋－ ＋－ ＋吴伟元，陈民钧等。中国临床药理学杂志，2001,70:104-109第60页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc61

90％的基因与阴沟肠杆菌的AmpC同源肺炎克雷伯菌质粒介导的MIR－1酶传播水解：头孢西丁头孢他啶头孢噻肟头孢曲松1988年美国Papanicolaou

质粒型AmpC酶第61页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc62第62页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc63如何推测大肠杆菌和肺炎克雷伯菌产生质粒AmpC酶？头孢西丁或头孢美唑 R三代头孢菌素 R/I/S加酶抑制剂类 R/I/S头孢吡肟 S碳青霉烯类 S第63页,共70页，2024年2月25日，星期天000405chmjampc64ESBL与AmpC的差别

ESBL高产Am