疏水层析法纯化蛋白质

岗位演练疏水层析法纯化蛋白质1任务五人干扰素α2b的疏水层析查阅资料，结合生活常识了解鸡蛋清组成及性质。查阅设计《疏水层析法纯化蛋白质操作记录》，在任务实施过程中同步填写。取鸡蛋蛋清，盐析法分别制得蛋白质溶液，再用疏水层析法分离蛋白组分，并检测分离的效果。设计实操设计（一）任务描述2（二）实训材料1.材料、试剂新鲜鸡蛋、上样缓冲液（20mmol/L，pH7.0磷酸钠盐，50％硫酸铵溶液）、硫酸铵。2.仪器设备5mLHiTrapPhenylHP预装层析柱（预填充有5mLPhenylSepharose6FF填料）、5mL注射器、50mL注射器或层析系统、高速冷冻离心机、0.22μm滤膜与滤器、紫外分光光度计。3（三）实训操作生产前准备样品的制备疏水层析柱平衡蛋白质溶液上样层析柱的洗涤蛋白质组分的洗脱层析柱的清洗与再生层析柱的保存12345678检测和分析910清场4（三）实训操作5步骤一

试剂配制配制20mmol/L，pH7.0磷酸钠盐缓冲溶液。步骤二

样品的制备取新鲜蛋清5mL于试管中，加入5mL去离子水混合均匀。计算该蛋清溶液硫酸铵质量浓度达75%所需要硫酸铵的量，准确称取硫酸铵，研磨后少量多次加入到蛋清溶液中。静置5min后8000r/min离心10min，弃上清液，取沉淀。将沉淀溶解于硫酸铵质量浓度为50%的20mmol/L，pH7.0磷酸钠缓冲液中，静置5min后8000r/min离心10min，取上清液弃沉淀，得上样溶液。用0.22μm滤膜过滤上样溶液。以紫外分光光度计测定溶液的吸光度，待用。（三）实训操作6步骤三

疏水层析柱平衡用注射器，以50mL上样缓冲液冲洗HiTrapPhenylHP预装柱，流速为3mL/min。步骤四

蛋白质溶液上样根据溶液吸光度，取适量上样溶液，以注射器或层析系统上样，总蛋白量200～500mg，流速为2mL/min。步骤五

疏水层析柱的洗涤用15mL上样缓冲液冲洗HiTrapPhenylHP预装柱或洗至A280

值回到基线，流速为3mL/min。（三）实训操作7步骤六

蛋白质组分的洗脱用阶梯洗脱法洗脱。每步依次分别采用10mL含40％、30％、20％、10％或0％硫酸铵的pH7.0磷酸钠缓冲液洗脱，流速2mL/min，以离心管持续收集洗脱液，每管1.5mL。步骤七

疏水层析柱的清洗与再生依次用25mL水、25mL1mol/LNaCl和25mL上样缓冲液冲洗疏水层析柱，使其获得再生，流速为3mL/min。步骤八

疏水层析柱的保存层析柱暂时不使用时，将柱内液置换成20%乙醇溶液。（三）实训操作8步骤九

检测和分析1.检测洗脱液取每管洗脱液，以280nm紫外分光光度计测定其吸光度值A280，判断管中蛋白质的浓度。然后，以电导率仪测定其电导率值，判断每管中硫酸根离子的浓度。2.结果分析以收集洗脱液的管号为横坐标，分别以吸光度值A280和电导率值，在同一坐标中绘制两条洗脱曲线，根据洗脱曲线判断蛋白质洗脱与硫酸铵浓度的关系。提示：若采用层析系统，开启电导率仪和检测器（检测波长设为280nm），可实时测定吸光度值A280和电导率值并形成层析图，根据层析图可直接判断层析效果。（四）任务分析与总结（1）任务中采用的HiTrapPhenylHP预装层析柱中填料的基质和配基分别是什么？生产中，疏水层析介质还有哪些常用的基质和配基？请比较这些配基的疏水性。（2）请比较疏水层析与反向层析的主要异同。（3）请简述疏水层析的操作步骤，以及反相层析的操作步骤。（4）选择题。反相层析中通常使用有机溶剂。为了生产安全，针对有机溶剂，需采取的措施有（）。A.依据MSDS采取防护措施