任务1 黑曲霉菌种活化、复壮及保藏-任务实施

情境2柠檬酸的发酵生产任务1：黑曲霉菌种活化、复壮及保藏07四月20242任务1：黑曲霉菌种活化、复壮及保藏任务描述保藏菌种时为减少变异，尽量降低菌的代谢活性。保藏的菌种拿出使用时，首先要转接到新鲜的培养基上并给予合适的培养条件让菌恢复生长，即进行活化。菌种在使用过程中，需有意识经常进行纯化和复壮，防止衰退。此次任务中，我们需要对保藏的菌种进行活化和复壮。具体任务包括：麦芽汁培养基的制备→制备平板和斜面→菌种分离纯化→根据变色圈选出活力高的菌株接种斜面→沙土管保藏菌种。07四月20243任务目标知识目标：1、掌握菌种保藏的原理及方法；2、了解菌种退化的原因和防止衰退的方法；3、了解菌种复壮的概念和方法；4、了解菌种活化的概念及方法。能力目标：1、学会菌种活化和复壮的操作方法；2、学会孢子斜面接种；3、学会沙土管保藏菌种的操作方法。素质目标：1、无菌意识07四月20244任务实施【实施准备】1、仪器设备超净工作台；恒温培养箱；灭菌锅；天平；水浴锅；接种环；涂布棒、移液管、试管、烧杯、500ml三角瓶、培养皿等若干，10mL无菌水试管1支，9mL无菌水试管6支。2、材料菌种：黑曲霉（本实验室保存）培养基：斜面培养基（麦芽汁培养基）：150g麦芽粉加入400mL60℃温水，搅匀，放入水浴锅内液化至加碘液不变蓝，煮沸，过滤得麦芽汁，加水调至50Be，琼脂2%，pH自然，121℃灭菌20min。分离培养基：上述斜面培养基加0.02%溴甲酚绿，pH自然，121℃灭菌20min。河沙、瘦黄土(有机物含量少的黄土)；07四月20245【实施步骤】

（一）菌种活化与复壮1、配制斜面培养基和分离培养基，和无菌水试管、涂布棒、移液管等一起灭菌；2、摆放斜面、倒平板，并对保藏的斜面菌种进行10倍梯度稀释至10-6，制成孢子悬液；3、选取10-4、10-5、10-6三个浓度稀释菌液，每个浓度分别取0.1mL，涂布两块平板。4、待菌液渗入培养基后倒置于培养箱，35℃培养；5、由于产酸，2-3d后菌落周围会出现黄色变色圈，在变色圈尚未连成一片时，测定变色圈与菌落直径之比，将比例大的单菌落进行标记；6、4-5d后待孢子成熟，移接于麦芽汁琼脂斜面培养基上，35℃培养至长出浓密孢子备用。07四月20246(二)菌种保藏（沙土管保藏法）L、沙土处理(1)沙处理：取河沙经40目过筛，去除大颗粒，加10%HCl浸泡(用量以浸没沙面为宜)2～4h(或煮沸30min)，以除去有机杂质，然后倒去盐酸，用清水冲洗至中性，烘干或晒干，备用。(2)土处理：取非耕作层瘦黄土(不含有机质)，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性，然后烘干，粉碎，用100目过筛，去除粗颗粒后备用。2、装沙土管

将沙与土按2：1，3：1或4：1(W/W)比例混合均匀装入试管中(10mm×100mm，装置约7cm高，加棉塞，并外包牛皮纸，12l℃湿热灭菌30min，然后烘干。3、无菌试验

每10支沙土管任抽一支，取少许沙土接入牛肉膏蛋白胨或麦芽汁培养液中，在最适的温度下培养2～4d，确定无菌生长时才可使用。若发现有杂菌，经重新灭菌后，再作无菌试验，直到合格。07四月202474、制备菌液

用5mL无菌吸管分别吸取3mL无菌水至待保藏的菌种斜面上，用接种环轻轻搅动，制成悬液。5、加样

用1mL吸管吸取上述菌悬液0.1～0.5mL加入沙土管中，用接种环拌匀。加入菌液量以湿润沙土达2/3高度为宜。6、干燥

将含菌的沙土管放入干燥器中，干燥器内用培养皿盛P2O5作为干燥剂，可再用真空泵连续抽气3～4h，加速干燥。将沙土管轻轻一拍，沙土呈分散状即达到充分干燥。7、保藏

沙土管可选择下列方法之一来保藏：(1)保存于干燥器中；(2)用石蜡封住棉花塞后放入冰箱保存；(3)将沙土管取出，管口用火焰熔封后放入冰箱保存；(4)将沙土管装入有CaCl2等干燥剂的大试管中，塞上橡皮塞或木塞，再用蜡封口，放入冰箱中或室温下保存。88、恢复培养