【生物】基因工程的基本操作程序课件-2023-2024学年高二下人教版选择性必修三

第2节基因工程的基本操作程序DNA合成仪

我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植的过程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。棉铃虫可以使棉花产量减少三分之一，严重时，甚至能使一片棉田绝收。大量施用农药杀虫，不仅会提高生产成本，还可能造成农产品和环境的污染。转基因抗虫棉(使棉铃虫死亡，左）与非转基因抗虫棉（右）

科学家将苏云金杆菌的“杀虫基因”——Bt抗虫蛋白基因转到棉花里，让棉花也能产生Bt抗虫蛋白（苏云金杆菌伴胞晶体蛋白）——破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。

从社会中来

1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？苏云金杆菌与载体拼接普通棉花（无抗虫特性）棉花细胞抗虫棉提取导入抗虫基因（Bt抗虫蛋白基因）重组DNA分子培育转基因抗虫棉的简要过程1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的

检测与鉴定实例：(含抗虫基因）（含有并表达抗虫基因）目的基因的筛选与获取目的基因1.概念：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因；如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。主要是编码特定蛋白质的基因，也可以是具有调控作用的因子一资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。目的基因2.筛选目的基因最有效的方法之一是从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。苏云金杆菌的杀虫作用于Bt基因有关掌握了Bt基因的序列信息对Bt基因的表达产物-Bt抗虫蛋白有较为深入的了解苏云金杆菌制剂可防治棉花虫害Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因实例：一目的基因的筛选和获取思考：1.Bt抗虫蛋白的抗虫原理是什么？2.抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？

当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。

Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响一目的基因的筛选和获取3.目的基因的获取✭获取目的基因的方法：①从基因文库中获取②人工合成③利用PCR获取和扩增目的基因前提：方法：DNA合成仪基因比较小、核苷酸序列已知通过DNA合成仪用化学方法直接合成基因组文库（某生物全部基因）部分基因文库（主要是cDNA文库）（三）利用PCR获取和扩增目的基因PCR的概念PCR是____________的缩写，是一项根据__________的原理，在____提供参与DNA复制的_______与_______，对__________________进行________的技术。①全称：______________________________②原理：______________________________③操作环境：__________________________④目的：______________________________⑤优点：______________________________聚合酶链式反应DNA半保留复制体外各种组分反应条件目的基因的核苷酸序列大量复制聚合酶链式反应DNA半保留复制体外（PCR扩增仪/PCR仪）对目的基因的核苷酸序列进行大量复制可以在短时间内大量扩增目的基因（以指数形式扩增）PCR扩增仪DNA复制所需的基本条件:参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶DNA母链（模板）4种脱氧核苷酸（原料）DNA聚合酶引物提供DNA复制的模板合成DNA子链的原料打开DNA双链（氢键）催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸（PCR用耐高温的DNA聚合酶）（PCR用高温代替）（PCR的引物2种）引物是一小段能与

的一段碱基序列__________的____________DNA母链互补配对短单链核酸3’5’DNA母链3’5’引物3’5’引物3’5’DNA母链（通常20-30个核苷酸）其他条件：一定的缓冲溶液(维持反应体系的pH）、Mg2+（激活DNA聚合酶的活性）、

控制温度变化DNA复制PCR技术场所遵循原则条件解旋方式酶特点结果PCR技术vsDNA复制碱基互补配对原则碱基互补配对原则模板、4种脱氧核苷酸、酶、ATP、引物模板、4种脱氧核苷酸、酶、引物(2种）DNA在高温下热变性解旋解旋酶催化半保留复制、边解旋边复制半保留复制、全解旋再复制体外复制细胞内（主要在细胞核内）大量的DNA片段形成整个DNA分子耐高温的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶等PCR反应引物是一小段DNA体内DNA复制引物为一小段RNA

PCR的两种引物的要求？

①不能自我环化②两种引物之间不能互补配对③长度不宜过短过程

目的基因DNA________后_______，____与单链相应________结合；然后以_______为模板在________作用下进行_____，即将4种_________加到__________，如此___________。每次循环一般可以分为_____、_____、_____三步。受热变性解为单链引物延伸互补序列单链DNADNA聚合酶引物的3’端脱氧核苷酸重复循环多次变性复性延伸PCR技术基本过程3’5’3’5’3’5’3’5’A.变性当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链B.复性（退火）当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合C.延伸当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’变性复性延伸条件：DNA模板、4种脱氧核苷酸、2种引物和TaqDNA聚合酶注：不需要ATP;由dNTP水解供能PCR技术第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物；第二轮循环的产物第三轮循环的产物完成后，常采用

来鉴定PCR的产物。琼脂糖凝胶电泳结果呈___________（n次扩增循环后，DNA数量约为___）*为什么呈指数形式扩增？______________________________________________________________________________________指数形式扩增2n一个循环得到的产物可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍n代后，共消耗_____个引物；第____代出现完整的目的基因2n+1-23思考：1.变性过程破坏的是哪种化学键？是否需要酶？2.引物是什么？在复性过程中引物结合到模板链的哪一端？3.使用的一对引物的序列相同吗？4.PCR过程是否需要ATP供能？5.PCR为什么需要引物？氢键不需要酶，需要90℃以上的高温短单链核酸3’端不需要，由dNTP水解供能DNA复制不能从头开始，DNA聚合酶只能由5′端向3′端延伸子链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增

不相同，目的基因两端具有不同的核苷酸序列*两种引物才能确保DNA的两条链同时被扩增（体内DNA复制）①全称：②操作环境：③原理：④前提：⑤条件：⑥过程：⑦优点：聚合酶链式反应体外（PCR扩增仪/PCR仪）可以在短时间内大量扩增目的基因（以指数形式扩增）DNA半保留复制已知目的基因的一段核苷酸序列（为了合成引物）模板DNA、4种游离脱氧核苷酸、引物（2种）、耐高温的DNA聚合酶变性：复性：延伸：DNA解链（超过90℃）引物结合到互补DNA链（50℃左右）Taq酶从引物起始进行互补链的合成（72℃左右）模板、原料、引物、酶、能量回顾：PCR技术用PCR可以扩增mRNA吗？mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA过程基因表达载体的构建（核心步骤）二基因表达载体重组DNA分子目的基因DNA限制酶限制酶DNA连接酶载体②能自我复制①有一个至多个限制酶切割位点③具有标记基因

④对受体细胞无毒载体应具备条件：限制酶切割位点标记基因复制原点载体的种类：质粒（常用）、噬菌体、动植物病毒目的基因DNA限制酶切割位点标记基因复制原点①

;②

。基因表达载体的构建二——核心步骤启动子：位于基因上游的一段有特殊序列的DNA片段RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动转录。终止子：位于基因下游的一段有特殊序列的DNA片段终止转录1.目的使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代使目的基因能够表达和发挥作用2.组成标记基因：目的基因：复制原点：鉴别或筛选含有重组DNA分子的受体细胞注意：目的基因必须插入到

与

之间。启动子终止子DNA复制的起始位点。重组DNA分子限制酶目的基因限制酶切割位点获取目的基因DNA连接酶基因表达载体构建模式图限制酶启动子限制酶切割位点终止子标记基因复制原点质粒同种限制酶或能产生相同末端的限制酶？基因表达载体的构建二——核心步骤基因表达载体3.过程培育抗虫棉的简要过程载体自身环化片段间的连接目的基因自身环化载体自身环化目的基因与载体连接目的基因与目的基因连接载体与载体连接正向连接

反向连接目的基因11’22’122’1’22’1’1如何解决这一问题？单酶切缺点：

思考：如果用同一种限制酶分别切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶处理后会出现几种产物？(只考虑两两结合)①载体、目的基因自身环化；②载体与目的基因反向连接双酶切！3种《报纸44期》P2左aba’b’旁栏思考题2.将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，效果会怎样？

有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物的总DNA提取出来，花粉管通道法导入受体植物，没有进行基因表达载体的构建。这种方法针对性差，完全靠运气也无法确定哪些基因导入了受体植物。将目的基因导入受体细胞三导入植物细胞导入动物细胞导入微生物细胞农杆菌转化法（双子叶植物和裸子植物常用）基因枪法（单子叶植物常用）花粉管通道法2.将目的基因导入受体细胞的方法：书本P80~P82——显微注射法——Ca2+转化法（我国科学家独创）1.转化的概念：

目的基因进入_________内，并且在受体细胞内_____和_____的过程。受体细胞维持稳定表达（受精卵）（原核生物）花粉管通道法（我国独创）②在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液(含目的基因）滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。简便经济，但要求花朵较大方法：实例：优缺点：我国“转基因抗虫棉”农杆菌转化法（最常用）

能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种

植物也取得了成功。农杆菌细胞内含有

，当它侵染植物细胞时，Ti质粒的

可转移至被侵染的细胞，并整合到该细胞的

。2.转化原理：1.农杆菌的特点：受体细胞为植物体细胞T-DNATi质粒大型环状DNA农杆菌T-DNA染色体DNA上单子叶Ti质粒构建基因表达载体时，目的基因该插到Ti质粒哪里？T—DNA上Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞目的基因插入植物细胞染色体DNA上表达新性状转入农杆菌农杆菌转化法（最常用）3.过程：植物组织培养农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入①两次拼接:第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上。

第二次拼接(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞的

染色体DNA上。②两次导入:第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌。

第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。《金版》P93方法规律1.显微注射法导入动物细胞——显微注射法将含目的基因的表达载体提纯受精卵显微注射含目的基因的受精卵具有新性状的动物雌性动物输卵管或子宫胚胎移植早期胚胎

细胞

处理大肠杆菌细胞

Ca2+感受态

与感受态细胞混合细胞吸收DNA分子基因表达载体使细胞处于一种能够吸收周围环境中的DNA分子的生理状态。注：原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。导入微生物细胞——Ca2+转化法因为没有内质网、高尔基体对蛋白质进一步加工。《报纸》44期P2右四目的基因的检测与鉴定①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质——“抗原—抗体杂交技术”2.个体生物学水平鉴定1.分子水平检测抗性检测：功能活性比较：PCR技术

或分子杂交技术目的基因成功表达的标志：合成相关蛋白质抗虫、抗病接种实验；基因工程产品与天然产品的功能活性比较——检测是否具有抗性以及抗性强度等方法—检测目的基因在受体细胞中是否稳定维持和表达目的基因的检测与鉴定（小结）PCR目的基因成功表达的标志：合成相关蛋白质—检测目的基因在受体细胞中是否稳定维持和表达①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因方法1：PCR扩增转基因生物提取DNADNA作为模板PCR操作M：marker；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系；转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果DNA半保留复制原理：四目的基因的检测与鉴定是否扩增出目的基因以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因）电泳操作原因：带标记的基因探针，与目的基因DNA单链在一定条件下互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。四目的基因的检测与鉴定①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因酶切转膜标记的DNA/RNA探针DNA分子杂交（Southern-blot)流程图以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因）方法2：

DNA分子杂交技术碱基互补配对原理：②检测目的基因是否转录出了mRNA方法：PCR扩增或分子杂交技术转基因生物提取RNARNA作为模板PCR操作电泳是否扩增出目的基因逆转录cDNA四目的基因的检测与鉴定提取RNA转膜标记的DNA/RNA探针RNARNA分子杂交流程图以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因）过程：用探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。③检测目的基因是否翻译成蛋白质方法：

抗原与抗体的特异性结合原理：苏云金芽孢杆菌提取Bt抗虫蛋白注射小鼠体内抗体标记抗体提取蛋白电泳分离抗原抗体杂交转基因生物四目的基因的检测与鉴定放射性检测

（杂交带）以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因）过程：提取转基因植物的蛋白质+相应抗体→是否出现杂交带抗原—抗体杂交技术2.个体生物学水平鉴定没有抗虫基因的棉花植株有抗虫基因的棉花植株棉铃虫没有死亡棉铃虫死亡接种棉铃虫四目的基因的检测与鉴定以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因）转Bt基因非转基因基因工程的基本操作步骤获取质粒、噬菌体等载体筛选和获取目的基因用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因表达载体将含有目的基因的表达载体导入受体细胞检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性1.目的基因的筛选和获取-前提2.构建基因表达载体-核心3.将目的基因导入受体细胞-关键4.目的基因的检测与鉴定-保证利用PCR获取和扩增目的基因、启动子、终止子、标记基因农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物)、Ca2+转化法(微生物);分子检测：是否插入、转录、翻译个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。一、概念检测1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因加整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。（1）将加基因整合到Ti质粒上就是构建基因表达载体。（

）（2）构建含有加基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。（

）（3）只要检测出番茄细胞中含有物基因，就代表抗冻番茄培育成功。（

）2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是（

）A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸√××D（1）科学家在培育“黄金大米”时，将ctrⅠ和psy基因导入含pmi基因的质粒中，构建了质粒pSYN12424。该项研究的目的基因是

，标记基因是

，质粒pSYN12424的作用是______。ctrⅠ基因和psy基因pmi基因将目的基因送入水稻细胞（2）在构建质粒载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列？为什么？不能。如果目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，限制酶可能将它切断。二、拓展应用（限制酶不能切割目的基因）探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定

DNA片段的扩增及电泳鉴定实践·探究一、实验原理1.DNA体外扩增（PCR）的原理PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的

与

。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。PCR的产物一般通过

来鉴定。2.DNA片段电泳鉴定的原理DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷

的电极移动，这个过程就是电泳。在凝胶中DNA分子的迁移速率与

等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的

下被检测出来。琼脂糖凝胶电泳相反解聚结合凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像紫外灯PCR仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液琼脂糖和核酸染料等二、材料用具用于向微量离心管中转移PCR配方中的液体，每吸取一种试剂后，其上的枪头都必须更换自动调控温度，实现DNA的扩增微量移液器一次性吸液枪头条件PCR反应体系的配方10倍浓缩的扩增缓冲液5ul20mmol/l的4种脱氧核苷酸的等量混合液1ul20umol/l的引物I2.5ul20umol/l的引物II2.5ulH2O28-33ul1-5U/ul的TaqDNA聚合酶1-2U模板DNA5-10ul总体积50ul注：模板DNA的用量为1pg-1ug二、材料用具

DNA片段的扩增及电泳鉴定实践·探究三、方法步骤用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使

。参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。循环程序变性复性延伸预变性940C，5min30次940C,30s550C,30s720C，1min最后一次940C，1min550C,30s720C，1min移液离心扩增

DNA片段的扩增及电泳鉴定实践·探究PCR技术反应液集中在离心管的底部使DNA充分变性，以利于引物更好地与模板结合PCR实验操作过程根据待分离DNA片段的大小，用

配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的

混匀。