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碱裂解法抽提大肠杆菌质粒碱裂解法抽提大肠杆菌质粒第1页1、试验目标：学习与掌握碱裂解法抽提大肠杆菌质粒DNA原理与方法碱裂解法抽提大肠杆菌质粒第2页2、试验原理：

碱裂解法抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA变性与复性差异而到达分离目标。碱裂解法抽提大肠杆菌质粒第3页3、试验步骤及各步注意事项1. 取1.4ml大肠杆菌培养液1rpm离心2min，弃上清，搜集菌体。

注意点：上清为培养基，必须尽可能倾倒洁净，并在吸水纸上吸干，如有较多培养基残留可能会影响后续试验。碱裂解法抽提大肠杆菌质粒第4页碱裂解法抽提大肠杆菌质粒第5页碱裂解法抽提大肠杆菌质粒第6页碱裂解法抽提大肠杆菌质粒第7页碱裂解法抽提大肠杆菌质粒第8页碱裂解法抽提大肠杆菌质粒第9页2. 加100µl溶液I，使菌体充分悬浮，室温静置3min。

注意点：必须充分混匀至看不见沉淀，可用移液器吹打或者用混匀器振荡。碱裂解法抽提大肠杆菌质粒第10页碱裂解法抽提大肠杆菌质粒第11页碱裂解法抽提大肠杆菌质粒第12页碱裂解法抽提大肠杆菌质粒第13页3. 加入200µl溶液II，温和上下颠倒2-3次，溶液转变为澄清透明。

注意点：不可猛烈振荡。碱裂解法抽提大肠杆菌质粒第14页碱裂解法抽提大肠杆菌质粒第15页碱裂解法抽提大肠杆菌质粒第16页4. 加入150µl溶液III，上下颠倒混匀数次，静置2-3min。

注意点：不可猛烈振荡，此时应出现白色沉淀。5. 1rpm离心5min。碱裂解法抽提大肠杆菌质粒第17页碱裂解法抽提大肠杆菌质粒第18页碱裂解法抽提大肠杆菌质粒第19页碱裂解法抽提大肠杆菌质粒第20页碱裂解法抽提大肠杆菌质粒第21页6. 取上清，加等体积（400µl）酚/氯仿/异戊醇，充分混匀，室温，1rpm离心5min。

注意点：酚氯仿有腐蚀性，盖严离心管盖，防止接触酚氯仿，如接触马上用水冲洗。碱裂解法抽提大肠杆菌质粒第22页碱裂解法抽提大肠杆菌质粒第23页碱裂解法抽提大肠杆菌质粒第24页碱裂解法抽提大肠杆菌质粒第25页7. 吸上层水相，再加1ml(约2.5倍体积）预冷无水乙醇，混匀。

注意点：一定防止吸到中间沉淀及下层酚氯仿。宁可损失一定上清。碱裂解法抽提大肠杆菌质粒第26页碱裂解法抽提大肠杆菌质粒第27页碱裂解法抽提大肠杆菌质粒第28页碱裂解法抽提大肠杆菌质粒第29页8. 4℃，1rpm离心10min。

9. 弃上清，加入0.5ml70％乙醇，4℃，1rpm离心5min。10. 弃上清，沉淀自然干燥10min后，加20µl无菌水溶解。

注意点：弃上清时尽可能将酒精倾倒洁净，但注意不要将沉淀弃去。碱裂解法抽提大肠杆菌质粒第30页碱裂解法抽提大肠杆菌质粒第31页碱裂

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