菌种选育理论与技术

关于菌种选育理论与技术菌种选育是一门应用科学技术理论基础：微生物学、微生物遗传学、生物化学、分子生物学、基因工程等。目的第2页,共49页，2024年2月25日，星期天简化生产工艺条件，缩短生产周期菌种选育的目的研究抗生素生物合成调控的机制科研生产分析抗生素生物合成途径获得带遗传标记的菌株了解菌种遗传背景改变产品组分、改进质量条件抵抗不良培养条件适应新的原材料提高产量提供分子遗传学研究材料产生新的生物活性物质第3页,共49页，2024年2月25日，星期天青霉素生产菌种的选育目前工业发酵水平经诱变85000U／mlWisQ176，900U／ml产黄青霉，20U／ml点青霉，2U／ml1943年，发霉的甜瓜1928年，Fleming第4页,共49页，2024年2月25日，星期天菌种选育的基本方法根据菌种自然变异而进行的自然选育。用人工方法引起菌种变异或形成新的杂种，再按照工业要求进行筛选来获得新的变种或杂种。

包括诱变育种，杂交育种，原生质体育种，基因工程育种等。第5页,共49页，2024年2月25日，星期天第一节

自然选育自然选育（naturalscreening）是指利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过分离、筛选排除衰退型菌株，从中选出维持或高于原有生产菌株的过程，以达到稳定或提高生产的目的。自然选育的目的淘汰衰退菌种，保存优良菌株，纯化菌种，防止菌种衰退，稳定生产，提高发酵产量。第6页,共49页，2024年2月25日，星期天一、菌种衰退的原因菌种遗传特性的改变经诱变剂处理后的退化变异

菌种生理状况的改变

（培养条件）导致衰退可能的原因：沙土管长期保藏、连续传代、新陈代谢产生的诱变物质、多因素低剂量诱变效应、互变异构现象等。第7页,共49页，2024年2月25日，星期天二、自然选育的一般过程第8页,共49页，2024年2月25日，星期天1、单孢子悬浮液的制备

定量稀释后制成50～200个单细胞／ml的菌悬液。2、分离及单菌落培养

根据计数结果，按丝状真菌、放线菌菌落大小不同，分离量以5～20个菌落／平皿为宜。3、筛选

将分离培养后的各型单菌落，接斜面培养，成熟后接入发酵瓶，测定发酵单位的过程称为筛选。它分初筛、复筛两个过程。

第9页,共49页，2024年2月25日，星期天优点

简单易行缺点

效率低，进展慢，难以获得高产突变株

以微生物的自然变异为基础的生产选种几率并不是很高，一个基因的自然突变频率仅10－6～10－10目的

纯化、复壮菌种第10页,共49页，2024年2月25日，星期天第二节

诱变育种诱变育种（mutationbreeding）是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群体，促进其突变率大幅提高，然后采用简便、高效的筛选方法，从中选出少数具有优良性状的突变菌株。优点：速度快，收效大，方法简便。缺点：诱发突变缺乏定向性，工作量大。诱变育种工作主要包括出发菌株的选择、诱变处理和筛选突变株三个部分。第11页,共49页，2024年2月25日，星期天出发菌株（沙土管或冷冻管）诱变育种的一般步骤第12页,共49页，2024年2月25日，星期天一、诱变剂的种类物理诱变剂：主要包括物理辐射中的各种射线

化学诱变剂：与DNA发生作用、改变其结构，并引起遗传变异的化学物质。生物诱变剂：一些能引起DNA结构改变，从而造成突变效应的生物体或生物分子。

第13页,共49页，2024年2月25日，星期天超净工作台小型X射线衍射仪Co60射线机第14页,共49页，2024年2月25日，星期天二、诱变育种的过程前突变：诱变剂所造成的DNA分子的某一位置的结构改变。

突变：由于染色体或基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。表型延迟：表型改变落后于基因型改变的现象。

第15页,共49页，2024年2月25日，星期天（一）诱变剂接触DNA分子前1、细胞对诱变剂的透性将影响诱变效果。2、细胞质的某些组分和某些酶可和诱变剂相互作用而影响诱变效果。3、与基因所处的状态有关，而基因的状态又和培养条件有关。

第16页,共49页，2024年2月25日，星期天（二）DNA损伤修复光修复作用（光复活作用）切补修复

四种酶的作用：核酸内切酶

、核酸外

切酶

、DNA多聚酶

、DNA连接酶重组修复SOS修复系统DNA聚合酶的矫正作用第17页,共49页，2024年2月25日，星期天第18页,共49页，2024年2月25日，星期天（三）前突变到突变的过程校正差错：光复活作用、切补修复和DNA多聚酶校正作用

引起差错：重组修复和SOS修复系统

一切影响这些修复系统中的酶活性的因素都能影响由前突变向突变转变这一过程

。诱变前后的处理可影响诱变的效果

：1、通过影响与DNA修复作用有关的酶的活性而影响诱变的效果；2、通过使诱变的目的基因处于活化状态(复制或转录状态)，使之更容易被诱变剂所作用，从而影响目的基因的突变率。

第19页,共49页，2024年2月25日，星期天(四)从突变到突变型1、分离性迟延

是经诱变处理后，细胞中的基因处于不纯的状态(野生型基因和突变型基因并存于同一细胞中)，突变型基因由于属于隐性基因而暂时得不到表达，需经过复制、分离，在细胞中处于纯的状态(一细胞中只有突变型基因，没有野生型基因)时，其性状才得以表达。2、生理性迟延

突变基因由杂合状态变为纯合状态时，还不一定出现突变表型，新的表型必须等到原有基因的产物稀释到某一程度后才能表现出来。

第20页,共49页，2024年2月25日，星期天三、诱变育种的步骤出发菌株的选择处理菌悬液的制备诱变处理中间培养突变株的分离和筛选第21页,共49页，2024年2月25日，星期天第22页,共49页，2024年2月25日，星期天四、突变株的筛选(一)随机筛选(二)理性化筛选（定向筛选）

运用遗传学、生物化学的原理，根据产物已知的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构来进行设计和采用一些筛选方法，以打破微生物原有的代谢调控机制，获得能大量形成产物的高产突变株。第23页,共49页，2024年2月25日，星期天第24页,共49页，2024年2月25日，星期天1、初级代谢产物高产菌株的筛选普遍存在着反馈抑制和反馈阻遏，要打破反馈调节系统，可从两个方面着手：

(1)

筛选细胞膜透性改变的突变株例如，谷氨酸发酵选育的高产菌株为谷氨酸棒杆菌的生物素营养缺陷型。第25页,共49页，2024年2月25日，星期天（2）筛选营养缺陷型突变株

营养缺陷型:诱变产生的缺乏合成某些营养物质的能力，须在基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。

野生型:与营养缺陷型对应的是野生型。

渗漏缺陷型:是遗传性障碍不完全的营养缺陷型，突变使某一种酶的活性下降而不是完全丧失，能少量地合成某一代谢产物。第26页,共49页，2024年2月25日，星期天(2)筛选结构类似物抗性突变株结构类似物：在化学和空间结构上和代谢的中间物（终产物）相似，因而在代谢调节方面可以代替代谢中间物（终产物）的功能，但细胞不能以其作为自身的营养物质第27页,共49页，2024年2月25日，星期天2、次级代谢产物(主要是抗生素)高产菌株的筛选利用营养缺陷型筛选

筛选负变株或零变株的回复突变株筛选去磷酸盐调节突变株筛选去碳源分解代谢调节突变株筛选氨基酸结构类似物抗性突变株

筛选二价金属离子抗性突变株筛选前体或前体结构类似物抗性突变株筛选自身所产的抗生素抗性突变株第28页,共49页，2024年2月25日，星期天1、抗性筛选抗性突变株的筛选相对比较容易，只要有10–6频率的突变体存在，就容易筛选出来抗性突变株的筛选常用的有一次性筛选法和阶梯性筛选法两种手段（三）理性化筛选的方法第29页,共49页，2024年2月25日，星期天（1）一次性筛选法一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境中，一次性筛选出少量抗性变异株抗噬菌体菌株筛选耐高温菌株筛选耐高酒精度、高渗透压的菌株也可分别在高浓度酒精或加蔗糖等造成的高渗环境下一次性筛选获得第30页,共49页，2024年2月25日，星期天（2）阶梯性筛选法无法知道微生物究竟能耐受多少高浓度的药物药物的抗性变异也是逐步发展的，时间上是渐进的梯度平板法纸片扩散法第31页,共49页，2024年2月25日，星期天吡哆醇与代谢拮抗物异烟肼的分子结构梯度平板法也常用于抗代谢拮抗物突变株的筛选，以提高相应代谢产物的产量。如：吡哆醇高产菌株筛选第32页,共49页，2024年2月25日，星期天

梯度平板法(Gradientplate)第33页,共49页，2024年2月25日，星期天

纸片扩散法与梯度平板法的原理类似，用打孔器将较厚的滤纸打成小圆片，并使纸片吸收一定浓度的药物，经干燥或不经干燥，放入涂布了菌悬液的平板上，一般9厘米的培养皿中等距放置三片为宜。经培养后观察围绕纸片的抑菌圈，抑菌圈内出现的可能就是抗性菌。纸片扩散法第34页,共49页，2024年2月25日，星期天阶梯性筛选法的缺点

阶梯性筛选法只有在抑制区域才能挑选抗性菌，而低浓度区域面积较大，优良的抗性突变株若被分散在低浓度区域或远离纸片的区域，则可能没有被检出，因此，漏检的几率较大。

第35页,共49页，2024年2月25日，星期天2、营养缺陷型突变株筛选与筛选营养缺陷型有关的三类培养基①基本培养基（MM，minimalmedium）：能满足某一菌种的野生型或原养型菌株营养要求的最低成分的合成培养基②补充培养基（SM，supplementalmedium）：在基本培养基中有针对性地补加某一种或几种营养成分，以满足相应的营养缺陷型菌株生长需要（其他营养缺陷型仍不能生长）的培养基③完全培养基（CM，completemedium）：可满足该菌各种营养缺陷型菌株营养需要的天然或半合成培养基第36页,共49页，2024年2月25日，星期天营养缺陷型突变株的筛选方法1)淘汰野生型抗生素法：将诱变处理液在MM中培养短时让野生型处于活化阶段，而缺陷型处于休眠状态且在培养基中加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型菌丝过滤法：对于霉菌，因孢子生长后会长出菌丝体，就可用滤纸过滤法将菌丝滤去，而缺陷型孢子却因未发芽而保留在处理液中第37页,共49页，2024年2月25日，星期天2)检出缺陷型原理：在固体基本培养基和完全培养基上，生长情况完全不同，缺陷型在CM上生长良好，而在MM上则不生长，野生型都能生长具体方法：影印法、点种法、夹层法第38页,共49页，2024年2月25日，星期天第39页,共49页，2024年2月25日，星期天也称任意法用接种针或牙签将CM上长出的菌落在MM和CM两副平板上接种，依次在相应位置点种，然后一起培养，观察其生长情况此法结果明确，但工作量大点种法第40页,共49页，2024年2月25日，星期天先在培养皿上倒一层基本琼脂培养基，凝固后涂上一层含菌的MM，凝固后再倒一薄层MM琼脂培养基，培养24h，将出现的菌落标记，然后倒上一层CM琼脂培养基，再培养。这时第二批长出的菌落就可能是缺陷型此法缺点是，结果有时不明确，而且将缺陷型菌落从夹层中挑出并不很容易夹层法第41页,共49页，2024年2月25日，星期天3)营养缺陷型生长谱的确定方法二以不同组合的营养混合物与融化凉至50℃的MM培养基混合铺成平皿，然后在这些平皿上划线接种各个缺陷型菌株于各相应位置，培养后根据在这些组合长出可推知其营养因子在5～6个平皿上可测20株菌以上。第42页,共49页，2024年2月25日，星期天第三节

杂交育种杂交育种是指将两个基因型不同的菌株经吻合(或接合)使遗传物质重新组合，从中分离和筛选具有新性状的菌株。杂交育种的目的在于：（1）通过杂交使不同菌株的遗传物质进行交换和重新组合，从而改变原有菌株的遗传物质基础，获得杂种菌株(重组体)；（2）可以通过杂交把不同菌株的优良生产性能集中于重组体中，克服长期用诱变剂处理造成的菌株生活力下降等缺陷；（3）通过杂交，可以扩大变异范围，改变产品的质量和产量，甚至出现新的品种；（4）分析杂交结果，可以总结遗传物质的转移和传递规律，促进遗