原核表达实验作业流程

原核表示步骤：第一步目标基因获取DH5a感受态制备PCR扩增pGEM-T载体重组载体1DH5a感受态细胞转化转化细胞1抽取质粒进行电泳酶切验证检验阳性（阳性）转化细胞1酶切，获取目标基因Pet28a/DH5a载体重组重组载体2第二步重组载体2DH5a感受态细胞转化转化细胞2抽取质粒进行电泳酶切验证检验阳性（阳性）转化重组载体3BL21感受态细胞转化细胞3诱导表示蛋白质提取SDS电泳检测呈阳性目标蛋白一.感受细胞制备体外连接DNA重组分子导入适宜受体细胞才能大量增殖。为了提升受体菌摄取外源DNA能力，提升转化效率以取得更多转化子，大家探索出了不一样方法处理细菌，使其处于感受态。现在关键采取电转化法和CaCl2法将外源DNA导入受体细胞中，并需要对应地制备电转化感受态细胞和CaCl2感受态细胞。本试验制备是电转化感受态细胞。试验原理：对于电转化法，因利用瞬间高压在细胞上打孔，所以需用冰凉超纯水数次洗涤处于对数生长前期细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽可能少导电离子。(109～1010转化子/μgDNA)试验材料：LB培养基（依据需要确定配制量）：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/lNaCl，加水至1000ml，高压灭菌，保留在室温。无抗生素LB琼脂糖平板培养基（依据需要确定配制量）：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/lNaCl，15g/l琼脂粉，加水至1000ml，高压灭菌；铺平板，冷却后在37℃10％甘油：10ml甘油加入90mlddH2O其它：DH5α大肠杆菌，灭菌玻璃平皿若干，接菌环，加100mlLB液体培养基500ml灭菌锥形瓶一个，灭菌50ml离心管若干，冰盒，移液器，灭菌移液器吸头，灭菌Eppendorf管等。试验仪器酒精灯，超净工作台，温控摇床，4℃试验方法(1)将大肠杆菌DH5a贮存菌液在无抗LB平板划线，37℃培养箱过夜培养（培养好平皿放入(2)从平板上挑取单菌落接种于5mL无抗生素LB培养基中，37℃振荡培养过夜；(3)根据1:50百分比接种过夜菌液至50mLLB培养基中，37℃猛烈振荡培养3小时左右，至OD600达0.3-0.6，最好是0.4(4)当OD600值达成0.4左右时，快速将菌液冰浴15~30分钟，不时缓慢摇匀以确保内容物充足冷却。将离心管置于冰上预冷，为下一步做准备。（为取得最大效率转化，在整个操作过程中菌液温度不超出4℃是关键，以下步骤务必在超净工作台和冰上操作）(5)将细菌培养物转移至冰凉50mL离心管中，4℃用JA转头（或和之相当转头）以2500rpm/min离心15min，以回收细胞。倒去培养液，用40(6)4℃用JA转头（或和之相当转头）以2500rpm/min离心20min，以回收细胞。倒去培养液，用25mL冰凉10%甘油重悬沉淀。(7)4℃(8)将细胞按40μL等份装入微量离心管，直接使用或-80℃(9)感受态细胞检测：取感受态细胞分别涂布含有氨苄青霉素和卡那霉素抗性LB平板，37℃(10)取1μg超螺旋质粒转化制备感受态，检测转化效率(通常情况下，没有必需正确计算，可用依据经验估量)。注：以上操作全部在无菌条件4℃冰浴技术关键点1）无菌操作；2）原始菌种要确保质量；3）感受态细胞分装保留时不宜体积太大；4）细菌活化以后，生长密度最好确保OD600为0.4-0.6；5）冰上分装感受态细胞；6）在－807）预防携带某种质粒其它细菌污染；8）预防其它杂菌污染。二.DNA连接和转化基础原理T4DNA连接酶最初分离于T4噬菌体感染大肠杆菌，可催化DNA5’磷酸基和3’羟基之间形成磷酸二酯键。在本试验中，将克隆载体pGEM-T和外源DNA片段用T4连接酶连接，可将外源DNA片段插入pGEM-T质粒中，构建外源DNA克隆质粒转化是指将质粒或以它为载体构建重组子导入细菌过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆增殖，便于后续分子操作。能够采取多个方法筛选和判定目标克隆。电转化法：外加于细胞膜上电场造成细胞膜不稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于DNA等大分子进入。同时DNA在电场中形成极性对于它运输进细胞也是很关键。试验材料质粒DNA，pGEM-T载体或PET表示载体，T4DNA连接酶，连接酶缓冲液10×buffer或2×快速连接缓冲液，灭菌纯净水，感受态细菌，LB液体培养基10ml，含有抗生素LB琼脂平板培养基3个，低温冰盒，微量移液器，Eppendorf管，一次性手套、涂菌棒等。试验仪器恒温水浴，温控摇床，台式离心机，37℃试验方法建立连接反应（1）准备经过酶切处理外源DNA片段和质粒载体；连接前先电泳确定待连接载体和片段浓度（2）配制连接反应体系（10μl反应体系）10×连接Buffer1μl（或2×快速连接Buffer5μl）T4连接酶1μl待连接样品xμl（PCR产物或胶回收产物，载体和片段mol比为1∶3-10）载体8-xμlor4-xμl（3）混匀样品并短暂离心使样品全部沉于管底。（4）将离心管置于连接酶要求温度孵育合适时间，通常为16℃，反应12－16小时。或4℃连接过夜电转化法制备大肠杆菌感受态细胞（1）从-80℃中取40μl感受态细胞于冰浴上融化5~10min，并将电转化杯冰浴(2)加入0.1~1μL纯质粒或2~5μL连接产物，轻轻吹打混匀，用移液器轻轻吸打均匀，置冰上。(3)将要转化混合物加入预冷1mm电转化杯中，电转化仪选择1800V作为输出电压，立即按下按纽电击。(4)将电击后转化细胞加入800μLSOC培养基中，于37℃恒温摇床上200rpm×(5)将菌液4000rpm/min离心3min，留200μL上清将菌体打散，均匀涂布于含合适抗生素琼脂平板表面（依据质粒所携带抗生素抗性基所以定），平板于37℃i.注：新倒平板可于37℃培养箱中预先放置数小时至过夜干燥，放在4℃ii.当转化是TA克隆连接产物时可在固体培养基上加入4μL1MIPTG和40μLl20mg/mlX-gal以进行蓝白斑筛选。三、重组基因检测基础原理质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表示关键载体，它在基因操作中含相关键作用。质粒分离和提取是最常见、最基础试验技术。质粒提取方法很多，大多包含3个关键步骤：细菌培养、细菌搜集和裂解、质粒DNA分离和纯化。本试验以碱裂解法为例，介绍质粒抽提过程，检测重组基因是否转化成功。在含质粒大肠杆菌混悬液中加入SDS和NaOH使菌体充足裂解，并使蛋白质和染色体DNA变性，加醋酸钠中和变性蛋白，染色体DNA及SDS沉淀，质粒DNA存于上清中，然后用乙醇深入纯化质粒。试验材料1）大肠杆菌DH-5α或BL212）溶液I：50mM葡萄糖；10mMEDTA；25mMTris-HCl，pH8.0。（Tris：三羟甲基氨基甲烷）。3）溶液II：0.2MNaOH;1%SDS,PH12.5。4）溶液III：3MNaAC；2M乙酸，pH4.8（盐酸调pH）。5）TE缓冲液：10mMTris-HCl，pH8.0；1mMEDTA.。6）RNA酶A溶液：10mg/mlRNA酶A，用TE配制，100°7）LB培养基：10g胰蛋白胨，5g酵母粉，5gNaCl加水至1000ml，用1MNaOH调pH至7.5，高压灭菌。8）氨苄青霉素：用去离子水配成100mg/ml储存液，过滤除菌，－20℃9）LA培养基：在LB培养基中加入终浓度100μg/ml氨苄青霉素。10）70%乙醇试验仪器超净工作台，台式离心机，电泳仪试验方法1.取1.5ml细菌培养物于已灭菌EP管中，1rpm离心1分钟，弃上清液，使细菌沉淀尽可能干燥；2.将细菌沉淀重悬于用冰预冷100µl溶液I(50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTApH8.0，25mmol/LTris-HClpH8.0)中，猛烈振荡；3.加入200µl新配制溶液II(0.2mol/LNaOH，1％SDS（m/v）)，盖紧EP管口，快速颠倒离心管5次，以混合混合物，确保离心管整个内表面和溶液II接触，不要涡旋，置于冰浴中；4.加入150µl预冷溶液III(每100ml溶液III中含60ml5mol/L乙酸钾，11.5ml冰乙酸，28.5mLH2O)，盖紧EP管口，反复颠倒数次，使溶液III在粘稠细菌裂解物中分散均匀，以后将管置于冰上3~5分钟；5.在最大转速下离心5min，取上清液于另一新EP管；6.用两倍体积乙醇室温沉淀双链DNA，振荡混合于室温放置2分钟，最大转速离心5分钟；7.小心吸去上清液，将离心管倒置于滤纸上，以使全部液体全部流出，在将附于管壁液滴除尽；8.加1ml70％乙醇洗涤沉淀，振荡混合，用12,000g离心2分钟，弃上清，将开口EP管置于室温使乙醇挥发，直至EP管中内没有可见液体存在（5～10分钟），用适量TE或ddH2O溶解；9.用0.5µlRNase37℃10.电泳判定。技术关键点1）每一步全部要充足混匀，为取得高产量DNA，第一步需使菌体完全重悬。2）加入碱溶液后，反复混匀使细菌充足裂解，但需要轻柔，一旦裂解（液体变清亮）必需立即加乙酸缓冲液中和。3）70%乙醇洗涤时，离心后应小心地将上清倒掉，注意这时DNA沉淀较疏松，易从管壁上脱落。四、质粒DNA琼脂糖凝胶电泳基础原理DNA在琼脂糖凝胶介质中，在电场作用下，从负极向正极移动，泳动速度取决于DNA大小和构型，电泳后经Gel-red染色，DNA可和其结合，在紫外光下发出荧光，DNA琼脂糖凝胶电泳可用于DNA判定，定量及纯化。2．材料、仪器1）TAE电泳缓冲液浓储存液50×：242gTris碱；57.1ml冰乙酸,100ml0.5mol/LEDTA(PH8.0)使用液1×：0.04mol/LTris--乙酸;0.001mol/LEDTA2）GEBS样本液6×缓冲液:15%聚蔗糖（Ficoll）（400型，Pharmacia）0.25%溴酚蓝3）溴化乙锭配成10mg/ml溶液，双蒸水配制，避光保留，用时1：0稀释。溴化乙锭为致癌剂，配制时预防皮肤接触。4）仪器DYY-III型稳压稳流电泳仪、水平电泳槽、微波炉、离心机，北京六一厂生产。凝胶成像系统，上海Tanon生物技术企业。3．方法1）0.8%琼脂凝胶板配制：取0.6g琼脂糖加80mlTAE（1×），20ml水，微波炉加热融化3分钟，将其冷却至55°2）充足凝固后从制胶槽中卸下凝胶板，放入电泳槽，加入TAE（1×），使其液面略高于琼脂糖板，拨出样品梳。3）DNA样品10μl加5μlGEBS样本液，在腊面纸上混匀，全部加样于琼脂糖板样品孔中。4）稳压电泳80V约2小时，使溴酚蓝指示剂泳动至合适位置，1-5V/cm。5）取出凝胶板置溴化乙锭溶液中染色20分钟。6）在凝胶成像仪观察结果。7）琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶比较：不一样浓度琼脂糖凝胶能够分离长度为200bp-50kbDNA。聚丙烯酰胺凝胶分离小片段DNA（5-500bp）效果最好。聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶相比有三个关键优点：基因分子生物学试验指导（1）分辨力强，长度仅相差0.2%（即500bp中1bp）DNA分子即可分开；（2）装载DNA量大，一个样品槽可装载10ugDNA；（3）从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA纯度很高。4．技术关键点1）选择琼脂糖凝胶浓度取决于所判定DNA大小，小片段DNA应用高浓度凝胶，大片段则用低浓度凝胶，在1%琼脂糖凝胶中溴酚蓝泳动速度和500bp双链线状DNA一致。不一样浓度琼脂糖凝胶及其可分离线性DNA大小范围见下表1。表1不一样浓度琼脂糖凝胶及其分离线性DNA分子有效范围