H-第六章-微生物的遗传和变异

第六章

微生物的遗传和变异杨毅红不被了解的大多数微生物无处不在，尽管科学家们在不断的努力，但绝大多数微生物是无法再实验室培养的。对这一类微生物我们该如何研究呢？主要内容遗传（保守性、稳定性）:亲代与子代相似“种瓜得瓜种豆得豆”负面：？“劣汰”“优胜”遗传和变异是生命的最本质特性之一正面：继承亲代优点，保持物种延续不适应变化的环境条件而死亡变异（多样性）:亲代与子代、子代间不同个体不完全相同“龙生九子，各不相同”细菌变异形式如：个体形态的变化，菌落形态(光滑型／粗糙型)的变异，营养要求的变异，对温度、pH要求的变异，毒性的变异，抗毒能力的变异，生理生化特性的变异及代谢途径、产物的变异等。遗传：亲代的性状在子代表现出来，使子代与亲代有相似的现象。变异：亲代与子代及子代各个体之间，无论在形态结构和生理机能方面，总会有差异，这种同类型不同个体之间的差异称为变异。一、遗传和变异的物质基础生物的各项生命活动都有它的物质基础。生物遗传的物质基础是什么呢？答案：DNA科学告诉我们，亲代将各种遗传性状通过DNA传递给了子代，子代获得DNA后形成一定的蛋白质，将遗传特性表现出来。哪些人用什么方法最终证明了遗传的物质基础是DNA呢？1.格里菲斯经典转化实验（1928）及埃弗里、麦克劳德、麦卡蒂等人的转化补充实验（1941）。2.赫西和蔡斯大肠杆菌T2噬菌体感染大肠杆菌实验。3.植物病毒的拆开与重建实验光滑型（SⅢ）粗糙型（RⅡ）有荚膜菌落光滑分泌毒素致病无荚膜菌落粗糙无毒不致病实验材料：肺炎链球菌（一）格里菲斯经典转化实验老鼠体内提取物培养现象活的SⅢ肺炎链球菌活的RⅡ

肺炎链球菌

无毒杀死

杀死

转化现象加热杀死后的破碎细胞混合注射加热杀死后的破碎细胞格里菲斯实验无毒注射注射？？埃弗里、麦克劳德、麦卡蒂转化补充实验从S型肺炎球菌活体上取得蛋白质、荚膜、DNA、RNA，分别与R型肺炎球菌混合后注入到小白鼠体内，结果被注入DNA的小白鼠死亡，其它小白鼠存活。DNA蛋白质多糖RNADNA是遗传物质只有DNA引起R型肺炎球菌转化

（二）赫西和蔡斯实验——噬菌体侵染细菌的实验（含S）（含P）蛋白质分子中只含硫不含磷，DNA只含磷不含硫用放射性同位素35S标记外壳蛋白质细菌内无放射性用放射性同位素32P标记内部DNA细菌内有放射性含RNA(核糖核酸）的烟草花叶病毒（TMV)进行了植物病毒重建实验。植物病毒蛋白质和RNA可以人为地分开,同时又可把它们重新组合成具感染性的病毒粒子.植物病毒的拆开与重建实验H.Fraenkel-Conrat(1956)

TMVHRVHRVTMV原始株拆开

重建感染分离纯化TMV---烟草花叶病毒HRV---霍氏车前花叶病毒结论：烟草花叶病毒中的遗传物质是RNA，而不是蛋白质。综上所述

核酸是一切生物的遗传物质，核酸包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），绝大多数生物都是以DNA作为遗传物质的，因此DNA是主要的遗传物质。

二、DAN的结构与复制（一）DNA的结构1.DNA的存在形式2.基因-遗传因子3.遗传信息的传递（二）DNA的复制（一）DNA结构

最经典的结构：双螺旋结构，沃森、克里克1953年提出。沃森（左）和克里克与DNA分子双螺旋结构模型双螺旋结构：DNA有两条核苷酸链彼此围绕同一根轴互相盘绕形成。每个单链均由脱氧核糖－磷酸－脱氧核糖－磷酸交替排列构成。每个核苷酸链上都有四个碱基：T——胸腺嘧啶A——腺嘌呤G——鸟嘌呤C——胞嘧啶彼此与另一条核苷酸链上的碱基组成碱基对：T—AA—TG—CC—G脱氧核糖碱基磷酸AGCT碱基基本单位－脱氧核苷酸AGCT脱氧核糖磷酸碱基腺嘌呤脱氧核苷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸胞嘧啶脱氧核苷酸

胸腺嘧啶脱氧核苷酸ATGCATGC一个DNA分子可包含几十万到几百万个碱基对，每个碱基之间间距为0.34nm。每10个碱基组成一个螺旋，螺距3.4nm。碱基之间一一对应，顺序固定，所以可以保证遗传的稳定性，但是，如果收到干扰，个别碱基排列顺序发生变化，都会导致微生物死亡或变异。1.DNA的存在形式主要是染色体，另外还有质粒定义：生物体内贮存遗传信息、能进行自我复制能力的遗传功能单位。是DNA分子上的具有特定碱基排列顺序的核苷酸片断。每个细菌约有5000～10000个基因。2.基因3.遗传信息的传递贮存在DNA上的遗传信息都会转录到RNA上，通过RNA的翻译作用指导蛋白质的合成，最终依靠蛋白质体现遗传性状。DNA复制和遗传信息传递的基本规则—中心法则（二）DNA的复制—半保留复制微生物为了保证遗传的稳定性，DNA的复制十分精确。复制过程：1.解旋：DNA双链氢键断裂，双链分开；2.复制：以各自双链为模板，进行复制。3.分配：新复制的核苷酸链与原来的一条核苷酸链按照碱基配对原则形成新的双链结构并分给子代。DNA半保留式的复制方式1868年的某天瑞士的生物化学家米歇尔(Miescher)研究一个病人的绷带，小心地将绷带上粘着的病人伤口处的物质洗下来。洗脱物中含有许多脓细胞。他向其中加入酒精，将细胞中的脂肪类物质除去，之后又加入含有胃蛋白酶的提取液清除各种杂蛋白，这样，他就可以拿到纯的浓细胞的细胞核了。于是米歇尔开始研究这些核。结果他意外地发现核中有一种从未认识到的新物质，并起名为“核素”。这就是现在我们知道的DNA。经过后人的研究，核素为酸性物质，含有三种成分：糖、磷酸、有机碱。又发现糖少了一个氧。称之为脱氧核糖。米歇尔的发现三、DNA的变性和复性DNA的解链曲线概念—变性DNA在适当条件下，分开的两条单链分子按照碱基互补原则重新恢复天然的双螺旋构象的现象。复性的DNA是随机结合的，只能部分保持原有性状。注意：DNA的复性是随机的。及复性的DNA不可能完全回复到原来状态。高温变性缓慢冷却热复性急速冷却复性失败四、RNA1、RNA和DNA组成的区别核糖代替脱氧核糖尿嘧啶（U）代替胸腺嘧啶（T）2、RNA的种类mRNA（信使RNA）tRNA（转运RNA）rRNA（核糖体RNA）反义RNA（调节DNA复制、转录和翻译）mRNA：信使RNA，带有氨基酸的信息密码（三联密码子），用于翻译氨基酸。tRNA：转移RNA，带有与mRNA互补的反密码子，能识别氨基酸和mRNA的密码。rRNA：与蛋白质形成核糖体，作为蛋白质的合成场所。(核糖体RNA)反义RNA：起调节作用，主要决定mRNA的翻译速度。1966年，Nirenberg和Khorana全部遗传密码字典

64个密码子

61个负责20种氨基酸翻译，3个无义密码子1968年诺贝尔奖五、遗传密码六、微生物生长与蛋白质合成DNA通过转录作用，将其所携带的遗传信息传递给mRNA,在三种RNA（mRNA、tRNA和rRNA）的共同作用下，完成蛋白质的合成。微生物的生长主要是蛋白质的合成共分成四个阶段：1.DNA的复制细胞将某特定段DNA链进行复制。2.mRNA的转录DNA双链打开后，以单链为模板，按照碱基配对原则复制RNA。将DNA上的信息转给RNA。蛋白质合成的过程3.翻译由tRNA完成。通过反密码子与mRNA密码子的互补，tRNA破译氨基酸的密码，进而将所需氨基酸送到核糖体处。4.蛋白质的合成按照特定的碱基顺序密码送到核糖体的氨基酸按照顺序连接在一起，在酶的作用下形成多肽链，进而形成蛋白质，最终将遗传信息表达出来。蛋白质合成的过程TCATGATTAAGTACTAATDNA的平面结构图细胞核中AGTACTAATACGU游离的核糖核苷酸DNA解旋，一条链为模板合成RNA细胞核中ACGUAGTACTAATDNA与RNA的碱基互补配对细胞核中聚合酶ACGU游离的核糖核苷酸ACGUUUAGTACTAATDNA与RNA的碱基互补配对细胞核中聚合酶ACG游离的核糖核苷酸ACGUUUU

细胞质

核孔DNAmRNA在细胞核中合成

细胞核内UCAUGAUUAAGTACTAATmRNAUCAUGAUUAmRNAAGTACTAATUCAUGAUUAmRNA

细胞核内

密码子

密码子

密码子

密码子

mRNA上决定一个氨基酸的三个相邻的碱基UCAUGAUAmRNAUAAUACUAUG

亮氨酸

天冬氨酸

异亮氨酸

氨基酸（原料）tRNA的一端运载着氨基酸

反密码子

亮氨酸UAA天冬氨酸ACU

异亮氨酸AUG

核糖体UCAUGAUAmRNAU

亮氨酸UAA天冬氨酸ACU

异亮氨酸AUG细胞质中

核糖体UCAUGAUAmRNAU

亮氨酸UAA细胞质中

核糖体UCAUGAUAmRNAU

亮氨酸UAA天冬氨酸ACU

异亮氨酸AUG细胞质中

核糖体UCAUGAUAmRNAU

亮氨酸UAA天冬氨酸ACU

异亮氨酸AUG缩合

亮氨酸天冬氨酸

异亮氨酸以mRNA为模板形成了有一定氨基酸顺序的蛋白质

细胞质中UCAUGAUAmRNAU原核微生物和真核微生物转录过程的区别

真核微生物RNA的转录是在细胞核内进行的，而蛋白质的合成则是在细胞质内进行的。所以，RNA转录后首先必须从核内运输到细胞质内，才能指导蛋白质的合成。

真核微生物一个mRNA分子一般只含有一个基因，编码一条多肽链；原核微生物的一个mRNA分子通常含有多个基因。在原核微生物中只有一种RNA聚合酶，催化所有RNA的合成；而在真核微生物中则有RNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ三种不同酶，分别催化不同种类型RNA的合成。原核生物中RNA聚合酶可以直接起始转录合成RNA，真核生物则不能独立转录RNA。在真核生物中，三种RNA聚合酶都必须在蛋白质转录因子的协助下才能进行RNA的转录。另外，RNA聚合酶对转录启动子的识别，也比原核生物更加复杂。七、微生物的细胞分裂DNA复制蛋白质合成核物质蛋白质均匀分配形成横隔膜子细胞子细胞第二节微生物的变异内容提要一、变异的实质—基因突变二、突变的类型(一）自发突变（二）诱发突变1.物理诱变2.化学诱变3.复合处理及其协同效应4.定向培育和驯化变异：微生物在形态或生理生化或其他方面的性状发生改变。基因突变：DNA中核苷酸序列发生可遗传的改变。可导致微生物进化和产生种内不同菌株。基因突变可以是DNA序列中单个核苷酸或碱基发生改变（点突变），也可以是一段核酸序列的改变（移码突变等）。一、变异的实质—基因突变基因型：生物DNA所包含的遗传信息。表现型：生物体展现出的特征。突变总是基因型改变，这种改变会不会反映在表现型，取决于突变的类型一种碱基被另一种替换

点突变——替换突变体正常体正常体同义突变错义突变

点突变——替换镰状细胞贫血症是一种血液疾病，可导致细胞形成特殊的形状，从而改变其携带血红蛋白的能力。正常细胞镰刀形细胞它是最早认识的一种分子病。流行于非洲，死亡率极高，大部分患者童年时就夭折，活过童年的寿命也不长，它是由于遗传基因突变导致血红蛋白分子结构的突变。错义突变的例子——镰状细胞贫血症突变类型及其对生物的影响突变类型对生物的影响点突变DNA中单个碱基改变，但由mRNA上密码子决定的氨基酸没改变对蛋白质无影响，“沉默突变”DNA改变，由mRNA上密码子决定的氨基酸也改变一个氨基酸被另一个氨基酸代替，蛋白质发生变化，有可能明显改变蛋白质的功能。DNA改变，在mRNA中产生一个终止子合成对生物无用的多肽链，同时阻止正常蛋白质的合成。移码突变在DNA中移除或插入一个或多个碱基改变整个密码子的序列，根本上改变氨基酸的序列；可能引入终止密码子和产生无用的多肽，取代正常的蛋白质。二、基因突变的类型按照突变的条件和原因划分：突变类型自发突变诱发突变多因素低剂量的诱变

互变异构效应：G-T、A-C

物理诱变化学诱变定向培育和驯化在微生物生长繁殖过程中，个别基因自发突变的概率极低。如细菌突变型频率：1×10-4~1×10-10(饥饿时，大肠杆菌的突变率增大，从而，因一些有利的突变而增加其生存的机会。)为了更快和更多地获得突变体，可用诱发突变达到目的。根据育种目标，从突变株中筛选出某些优良性状的突变株…..诱变剂1.物理诱变紫外辐射、X射线、γ射线、快中子、β射线和激光等。以紫外线为例，物理诱变机制和DNA的损伤修复机制：DNA链上碱基对紫外辐射敏感，DNA强烈吸收紫外辐射引起DNA结构的变化。

如：DNA链断裂，DNA分子内和分子间交联，核酸与蛋白质交联，G、C的水合作用及胸腺嘧啶二聚体的形成(双链扭曲变形，不能正常配对)胸腺嘧啶二聚体光复活：紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下，可明显降低死亡率的现象。光复活酶（光裂合酶）与二聚体结合，在可见光下获得能量，使二聚体解聚，受损伤的DNA得到修复。暗复活：受损伤的DNA也可能在黑暗时被修复成正常DNA。某些细菌不被复活的DNA或是变异，或是死亡DNA损伤的修复紫外辐射对DNA的破坏和DNA的修复日光浴者会招致紫外线引起的二聚体，如果得不到修复，就会引起皮肤癌。着色性干皮病是一种遗传性疾病，缺失正常修复紫外线损伤DNA所需的酶。……如经DNA修复后有缺陷，DNA就会发生突变………发展成癌细胞尽管光复活有利于细菌的生存，但却给微生物学家出了难题。紫外诱变的培养物必须培养在黑暗环境中，以维持突变。2.化学诱变在分子水平上改变DNA的碱基序列，诱变剂包括：（1）碱基类似物：会掺入到DNA正常碱基的位置，导致配对错误。咖啡因：会导致新生儿突变，因此往往建议孕妇避免或限制摄入咖啡因。一杯咖啡中大约含有100～150毫克咖啡因。国外资料表明，咖啡因有造成胎儿腭裂以及其他畸形的危险。即使每天只摄取150毫克以下的咖啡因，但分娩出低体重儿的危险却增加1.5倍。复合处理及其协同效应突变率普遍比单独处理的高：（1）两种或多种诱变剂先后使用；（2）同一种诱变剂重复使用；（3）两种或多种诱变剂同时使用。4.定向培育和驯化

人为用某一种特定环境长期处理某一微生物群体，同时不断将它们进行移种传代，以达到累积和选择合适的自发突变体。

环境工程中常用这种方法培育新菌种。细菌的选育与细菌的变异选育—筛选与定向培育筛选—“众里挑一”定向培育—“教育培训”定向培育在水的生物处理俗称驯化。(1)细菌的筛选方法原理：优胜劣汰方式：选择性培养基（天然+人工）天然——特殊区域采样例如筛选能降解石油的细菌？收集长期被石油污染的土壤(天然选择性固体培养基），必有适应石油环境利用石油作为食物的细菌，将土壤样品在实验室用石油降解菌选择性培养基，对样品中的石油降解菌进行进一步的选择培养，筛选分离，富集，为下一步的驯化工作奠定基础。

驯化选择性培养基（石油）浓度升高筛选分离23、414小考1中考高考

（2）细菌的驯化①渐变－诱导法(休眠的酶基因复活+自然突变)方法：待降解物通常为有机毒物或惰性物。567N选择性培养基（待降解物，如石油）浓度升高5n大一→大四N+1死筛选与诱导驯化可以同时进行特点:操作简便，驯化的潜力有限，慢。结果诱变剂：温度、紫外线、核辐射、酸、碱、化学诱变剂等等。②突变—诱变法引起基因突变的因素评价通常生产上更多利用的是诱导法。污泥培养初期逐步提高污水比例，有些菌种不能适应被淘汰(筛选)，能产生诱导酶的菌株及自发突变体中能来降解此类废水的菌种能够生存而被保留下来，且能力逐步提高，使废水达到预期的排放标准；第三节基因重组概念：两个不同性状的细胞DNA融合，使基因重新组合，导致遗传变异，产生新品种的过程。形式自发基因重组与人工基因重组自发基因重组a.真核生物为杂交；精卵细胞质融合过程中所有遗传物质的重组b.原核生物为转化、转导、接合；部分遗传物质的转移和重组工业间谍（地下工作者）的拿来主义引进

合作开发细菌亦然

转化供体细菌研碎物中的DNA片段直接吸收进入活的受体细菌并发生基因重新组合的方式。受体细菌获得了供体细菌的部分遗传性状—“转运同化”格里菲斯实验（证明DNA是生命遗传物质的经典实验之一）。目前发现自然状态下许多其它细菌、放线菌、真菌和高等动植物中都也有转化现象。（引进）引进接合：直接接触进行基因转移

（合作）

转导（间谍窃取）间谍？噬菌体－细菌病毒通过噬菌体的携带而转移导手的基因重组现象称为转导。转导是1951年辛德尔(Zinder)和莱德贝尔格(1Jederberg)在研究鼠沙门氏伤寒杆菌重组时发现的。细菌有性生殖特点：利用温和噬菌体做载体，将供体特定基因携带给受体细胞，使后者得到前者部分遗传性状的现象。注意：受体细胞和供体细胞不进行直接接触，靠的是温和噬菌体的媒介作用。极少数噬菌体在成熟过程中包裹了宿主的DNA片段LA-2A-B+LA-22A+B-LA-2是能合成色氨酸（B+）但不能合成组氨酸（A-）的沙门氏伤寒杆菌

指导色氨酸合成的基因超微烧结玻璃板细菌不能通过，噬菌体可以通过转导能合成色氨酸间谍侵入、重组“转移、导手”LA-22

是

合成色氨酸（B-）但能合成组氨酸（A+）的沙门氏伤寒杆菌一些细胞中含有繁殖速度较慢的温和噬菌体P-22

不能转导的意义从一个细胞向另一个细胞传递遗传物质并改变受体细胞的遗传特征。前噬菌体可以在细胞中存在较长时间，提示了病毒引起癌症的可能机制。如，可能用来解释动物病毒如何引起肿瘤病变的（插入人类染色体的病毒基因可能会破坏某些基因的调节，使结构基因在错误时间被激活…)一个有趣的联想是一些动物病毒可能在侵染新的人类宿主时，携带了原宿主的基因。而那些原宿主不一定是人类。你可能是“转基因的”….第四节突变体的检测与筛选（1）营养缺陷型:野生型菌株由于发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子的能力，因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型。（2）抗性突变型:由于基因突变而使原始菌株产生了对某种化学药物或致死物理因子抗性的变异类型。它们可在加有相应药物或用相应物理因子处理的培养基平板上选出。（3）条件致死突变型:某菌株或病毒经基因突变后，在某种条件下可正常地生长、繁殖并实现其表型，而在另一种条件下却无法生长、繁殖的突变类型，称为条件致死突变型。Ts突变株（温度敏感突变株）是一类典型的条件致死突变株。突变体的类型（4）形态突变型:指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异。前者如可影响孢子有无、孢子颜色、鞭毛有无或荚膜有无的突变，后者如可引起菌落表面光滑、粗糙、噬菌斑的大小或清晰度等的突变。（5）抗原突变型:指由于基因突变而引起的抗原结构发生突变的变异类型。具体类型很多，包括细胞壁缺陷变异、荚膜变异或鞭毛变异等。（6）产量突变型:通过基因突变而获得的在有用代谢产物产量上高于原始菌株的突变株，称为产量突变型。由于产量性状是由许多遗传因子决定的，因此，产量突变型的突变机制是很复杂的，产量的提高一般也是逐步累积的。这类突变在生产实践上异常重要。一、突变体的检测1、直接检测表现型2、间接检测法—通过控制培养条件获得突变体。二、突变体的筛选

筛选方法：创造一种只允许突变体生长，抑制原养型菌生长的培养基或生长环境条件。一、突变体的检测直接检测表现型影印平板法

ReplicaPlatingTechnique（二）间接检测法有许多突变体不能用直接检测获得，如高温菌、嗜酸菌及营养缺陷型的微生物要通过控制条件而获得。Ames试验。第五节分子遗传学在环境工程与环境保护中的应用一、遗传工程在环境保护中的应用a.

遗传工程的方法遗传工程方法包括两个水平的研究：一种是细胞水平；另一种是基因水平。所以，又可把它分为细胞工程和基因工程。细胞工程——两个细胞原生质体融合

体外切割导入遗传物质基因片段受体细胞基因工程——两个细胞DNA片段剪接拼接狭义的讲，遗传工程就是基因工程。原理：限制性核酸内切酶你想发光吗？水晶水母发光老鼠荧光猪图中的小老鼠是1997年7月在大阪大学降生的，它们成为第一种能够在夜里发光的哺乳动物。研究人员可利用荧光老鼠研究胎儿发育等。老鼠之所以发光，是因为其体内转入了水母荧光蛋白基因。荧光猪，这是科学家把水母绿色荧光蛋白基因转入猪体内制造出来的。在紫外线的照射下，荧光猪的蹄子、鼻尖和舌头这些没有被毛发遮盖的部位都能够发出荧光。1992年，生物学家将水母绿色荧光蛋白的基因克隆了出来。2008年诺贝尔化学奖奖得主钱永健、下村修和马丁·沙尔菲第一次分离出的荧光基因，也就是从上面照片中的这种水晶水母体内获得的。来一个转基因宠物？美国官方批准的第一个转基因宠物！这些源自东南亚的斑马鱼，是只有英寸长的热带水生鱼，由于已被插入一段海生珊瑚的基因，它们可以发出红光和蓝光，尤其是在紫外灯照射下。一旦发光便不能停止。1、质粒：原核微生物中，游离于核基因组外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状DNA分子。2、质粒的类型接合性质粒抗药性质粒产细菌素和抗生素质粒具生理功能的质粒（如降解质粒）产毒质粒b.

遗传工程在环境工程中的应用（一）质粒育种简介3.质粒育种（1）多功能超级细菌的构建降解芳烃、萜烃、多环芳烃和脂烃（2）解烷抗汞质粒菌的构建降解辛烷、乙烷、癸烷和耐高浓度汞（3）脱色工程菌的构建分解两种偶氮染料（4）Q5T工程菌的构建在低温下降解甲苯和二甲苯Ⅰ.降解石油的超级细菌70年代美国生物学家查克拉巴蒂针对海洋输油，造成浮油污染。虽发现90多种微生物有不同程度降解烃类的能力，但不一定能在海水中大量繁殖生存，而且降解速率也较慢，查氏将能降解脂(含质粒A)的一种假单胞菌作受体细胞，分别将能降解芳烃(质粒B)、芳烃(质粒C)和多环芳烃(质粒D)的质粒，用遗传工程方法人工转入受体细胞，获得多质粒“超级细菌”，可除去原油中2／3的烃。浮油在一般条件下降解需一年以上时间，用“超级细菌”只需几小时即可把浮油去除，速度快效率高。基因工程：有意识地把一个生物体中有用的目的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产物。用人工的方法把所需要的某一供体生物的DNA提取出来，在离体的条件下用限制性内切酶将离体DNA切割成带有目的基因的DNA片段，用DNA连接酶把它和质粒（载体）的DNA分子在体外连接成重组DNA分子，导入某一受体细胞，重组体克隆的筛选和鉴定；最后对外源基因表达产物进行分离提纯，从而获得新品种。二、基因工程在环境保护中的应用基因工程操作一般步骤：获得目的基因；与载体连接形成重组DNA；将重组DNA转入受体细胞；重组体克隆的筛选与鉴定；外源基因表达产物的分离与提纯。获得需要的目的基因常用的方法：（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因文库(genelibrary)，从中调用目的基因；（2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段；（3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段。获得需要的目的基因（外源基因）

细胞内总DNA的提取分离与基因文库的构建

细胞内总DNA的提取分离程序

紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度。

基因文库的构建将总DNA包含的基因组各片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，便构成了该生物的基因文库。基因重组和克隆操作最重要的工具是限制性内切酶、载体和宿主菌。微量的目的基因必须经过基因克隆获得大量的拷贝后，才能实现进一步的重组、转化和表达等操作。构建重组质