形态学实验-荧光显微镜的成像原理与使用

荧光显微镜的成像原理与使用实验五1一、荧光显微镜

荧光显微镜的成像原理

荧光显微镜是一种较为常用的的光学显微镜，其基本原理是利用一定波长的激发光对样品进行激发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。3荧光显微镜的成像原理4物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光：物质吸收短波光，发射出的长波光。什么是荧光?5保持固有的荧光特性荧光波长＞激发波长荧光强度极小于激发光的强度有不同程度的衰减荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度荧光的性质6自发荧光二次荧光荧光的种类7优点：检出能力高对细胞的刺激小能进行多重染色用途：物体构造的观察荧光的有无、色调比较进行物质判别发荧光量的测定对物质定性、定量分析荧光显微镜的优点和用途8荧光显微镜的分类荧光显微镜就其光路来分有两种：

1．透射式荧光显微镜

激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的。常用暗视野集光器，也可用普通集光器，调节反光镜使激发光转射和旁射到标本上．这是比较旧式的荧光显微镜。其优点是低倍镜时荧光强，而缺点是随放大倍数增加其荧光减弱．所以对观察较大的标本材料较好。

2．落射式荧光显微镜

这是近代发展起来的新式荧光显微镜，与上不同处是激发光从物镜向下落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜。光路中需加上一个双色束分离器，它与光铀呈45。角，激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜，反回到双色束分离器，使激发光和荧光分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。如换用不同的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的组合插块，可满足不同荧光反应产物的需要。此种荧光显微镜的优点是视野照明均匀，成像清晰，放大倍数愈大荧光愈强。9透射式荧光显微镜落射式荧光显微镜10荧光素的特性11荧光显微镜使用方法1．打开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才能达到最亮点。2．透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装上所要求的激发滤片，在物镜的后面装上相应的阻断滤片。落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的插块。3．用低倍镜观察，根据不同型号荧光显微镜的调节装置，调整光源中心，使其位于整个照明光斑的中央。

4．放置标本片，调焦后即可观察。

12使用注意事项1.激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象，因此尽可能缩短观察时间，暂时不观察时，应用挡板遮盖激发光。2.荧光几乎都较弱，应在较暗的室内进行。3.末装滤光片不要用眼直接观察，以免引起眼的损伤。4.高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需经5分钟后才能再启动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。5.电源最好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。13二、荧光显微镜技术荧光素直接标记技术免疫荧光技术（直接免疫荧光技术和间接免疫荧光技术）荧光原位杂交技术（荧光素直接标记探针）荧光显微镜技术15间接免疫荧光技术原理16间接免疫荧光实验过程固定（如需对活细胞进行研究除外）固定细胞的透化处理，使抗体能透入细胞内封闭可能产生非特异反应的位点用特异抗体对固定细胞/组织进行标记将样品制备成可进行显微镜观察的标本17荧光显微镜技术在生命科学研究中的应用对细胞结构或组分的定性、定位、半定量研究作为生物大分子筛选与鉴定的标记物1819FITC+TexasRed+DAPI多重染色标本的多色观察20双重染色标本的单色和双色观察DAPI+FITCFITC+PI21三、激光共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜2324

普通荧光显微镜的不足

使用荧光物质标记细胞中的特定成分或结构，不仅图像与对比度增强，而且由于许多荧光显微镜的光源使用短波长的紫外光，大大提高了分辩率（D=0.61λ/NA）。但当所观察的荧光标本稍厚时，普通荧光显微镜不仅接收焦平面上的光量，而且来自焦平面上方或下方的散射荧光也被物镜接收，这些来自焦平面以外的荧光使观察到的图像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的荧光结构模糊、发虚，原因是大多数生物学标本是层次区别的重叠结构）。25共聚焦扫描显微镜的成像原理采用点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。两者的几何尺寸一致，约100-200nm；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。26每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面，这个光学横短面总是有一定厚度的，又称为光学薄片。由于焦点处的光强远大于非焦点处的光强，而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的景深近似为零，沿Z轴方向的扫描可以实现光学断层扫描，形成待观察样品聚焦光斑处二维的光学切片。把X-Y平面（焦平面）扫描与Z轴（光轴）扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，经过计算机软件处理，可以获得样品的三维图像。27ConfocalPrinciple2829观察方式：以荧光为主光源：激光（紫外、可见光、近红外）照明方式：点照明、逐点扫描成像方式：共聚焦、逐点成像输出：实时观测,数字化图像，可以进行图像处理和定量分析多重染色样品的观察高分辨率普通显微镜 0.61λ/NA

共聚焦显微镜 0.55λ/NALSCM的基本特点30共聚焦扫描显微镜在生命科学研究中的应用细胞结构、蛋白质（如受体、抗原、抗体、酶、细胞骨架蛋白等基因表达产物）、DNA、RNA等细胞膜流动性（荧光光漂白恢复技术）细胞内氧自由基活性细胞内钙离子浓度变化膜电位313233

Feulgen反应的基本原理：

稀HCl水解DNA，破坏嘌呤和脱氧核糖间的配糖键，并在脱氧核糖C1端形成游离的醛基，Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子,因醌基为发色团，故可呈现出紫红色。也就是说,DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。实验六

核酸的显示—Feulgen反应3435实验步骤:1.在载玻片糙面做好标记，以免实验时弄反正反面。2.取鸭血，血涂片，室温凉干，甲醇室温固定5min，凉干;3.蒸馏水过一下；(蒸馏水自己拿缸装)4.1mol/L盐酸(600C)水解8-10min;（水浴锅中）5.1mol/L盐酸（室温）1min;6.蒸馏水稍洗；7.置Schiff试剂中室温染色1h左右；（临用前提供）8.亚硫酸盐溶液（Ⅰ）（Ⅱ）（Ⅲ）洗3次，总时间为6min;9.自来水冲洗1-2min，蒸馏水稍洗；10.用1%亮绿水溶液复染5-10min；自来水冲洗2min，蒸馏水稍洗；11.甘油/PBS封片剂封片；12.普通光学显微镜观察。36血涂片：37染色缸侧面示意图载玻片（背靠背）注意：载玻片插入染色缸中应插在凹槽中，尽量避免两片载玻片贴在一起，否则会摩擦掉上面的细胞。染色缸的使用:38注意事项涂片时最好在载玻片上端一角做好标记，以免实验时弄反正反面。涂片区从玻片长度的1/2到糙面远端。涂片完需待其完全干燥后，方可加甲醇固定液中固定，否则涂上的细胞会大量脱落。酸水解时必须掌握合适的浓度、水解温度和时间，如果酸水解不足，会造成醛基暴露不完全；反之会造成DNA间键的断裂溶解，对DNA的定量测量产生不良影响。在Schiff试剂中染色（尽量在避光处反应）时，如室温过低会影响染色效果，使染色极浅。可适当加温（置于30度左右温箱中）或延长反应时间。亮绿浓度不能过高，染色时间不能过长，否则整个细胞包括细胞核区均会染色过深而看不出紫红色。

39吖啶橙（AcridineOrange，AO）是一种荧光色素，其激发滤光片波长488nm。阻断滤光片波长515nm。它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光，与DNA结合量少发绿色荧光，与RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光。该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。因此，在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光，或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。

实验七

核酸的吖啶橙染色4041实验内容及方法鸭血细胞染色观察：

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